为深入探究miRNA参与调控香鳞毛蕨(Dryopteris fragrans)生长发育的分子机理,依据实验室前期建立的miRNA数据库,筛选出与非生物胁迫相关的差异表达dfr-miR160a前体(dfr-pri-mir160a),预测其靶基因为DfARF10,并通过本氏烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时共转化GUS以及双荧光素酶(LUC)系统验证dfr-miR160a和DfARF10的靶向关系.结果显示,共注射dfr-pri-mir160a和DfARF10的本氏烟草叶片中GUS活性和LUC活性明显降低;qRT-PCR分析显示,dfr-miR160a及其靶基因DfARF10在香鳞毛蕨的根、配子体、叶柄、叶片和孢子囊中均有表达,在叶片中表达量最高,在根中表达量最低;通过qRT-PCR分析干旱、盐(NaCl)、高温和低温胁迫对dfr-miR160a及其靶基因DfARF10表达的影响.结果表明,在干旱和高温处理下,dfr-miR160a的表达均上调,但在NaCl处理下,dfr-miR160a的表达下调;低温处理下,dfr-miR160a的表达在0-1小时下调,在3-48小时上调.在NaCl、高温以及低温处理下DfARF10表达均上调;但在干旱处理下,DfARF10表达下调,与dfr-miR160a呈现相反的表达趋势.综上,dfr-miR160a靶向DfARF10基因且二者均能响应非生物胁迫.研究结果为从分子层面揭示香鳞毛蕨非生物胁迫抗性机制提供了新的科学依据.

目的 研究香鳞毛蕨醇提物对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的人真皮微血管内皮细胞(human dermal microvascular endothelial cells,HDMEC)炎性反应的影响.方法 分别用0、0.4、2和10μg/ml的LPS作用于人真皮微血管内皮细胞,孵育24h建立微血管内皮细胞炎性模型.实验分为HDMEC空白对照组、LPS模型组和LPS+香鳞毛蕨药物组,分别进行药物处理,观察不同剂量香鳞毛蕨醇提物处理对各组HDMEC细胞增殖和炎症相关基因mRNA表达的影响.结果 香鳞毛蕨醇提物可以抑制2μg/ml LPS刺激下的微血管内皮细胞的增殖(P＜0.05),并降低脂多糖所诱升的血管内皮生长因子VEGF以及炎症相关基因NF-κB、VCAM-1的表达水平(P＜0.01).结论 香鳞毛蕨醇提物可能通过抑制炎症相关基因的表达来抑制微血管内皮细胞的炎性增殖.

目的探讨香鳞毛蕨有效部位(DF)体外抗犬小孢子菌(Microsporum canis)的作用及机制.方法采用微量稀释法测定DF对M.canis的最低抑菌浓度(MIC)以及最低杀菌浓度(MFC),从生物量的生成、山梨糖醇保护试验、麦角甾醇结合试验、细胞泄漏以及对麦角甾醇含量的影响等角度,探究DF的抗菌机制.结果DF对M.canis的MIC及MFC几何均值的范围分别为0.298～0.596 mg/mL和0.334～0.668 mg/mL.与生长对照组相比,DF高剂量组、阳性药物组均能显著性降低M.canis的生物量和麦角甾醇的含量(P<0.01),和明显增加胞内物质的释放(P<0.01);无论是否加入外源性山梨糖醇和麦角甾醇,DF对M.canis的MIC值均无变化.结论DF对M.canis具有良好的体外抗菌效果,其机制可能是通过影响麦角甾醇的合成,或破坏细胞的完整性而实现.

目的 建立香鳞毛蕨Dryopteris Fragrans有效部位中10种间苯三酚类成分的一测多评测定方法.方法 采用高效液相色谱法,以绵马素BB为内参物,测定其与绵马素PB、绵马素AB、黄绵马酸BB、田基黄绵马酸A、黄绵马酸PB、异黄绵马酸PB、黄绵马酸AB、Compound VI和绵马酚B的相对校正因子,采用相对校正因子计算这9种间苯三酚成分的量,实现—测多评.同时采用外标法测定有效部位中该10种成分的量,并比较2种测定方法的差异,以验证一测多评法的可行性和准确性.结果 各相对校正因子重复性良好,12批有效部位中10种间苯三酚成分量的计算值与实测值无显著性差异.结论 在缺少对照品的情况下,以绵马素BB为内参物,建立的一测多评法可用于香鳞毛蕨有效部位的定量分析,为香鳞毛蕨多指标成分质量评价提供参考.

目的 研究香鳞毛蕨乙醇提取物(DF)对红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)的抑制作用及分子机制.方法 采用转录组测序技术研究DF对红色毛癣菌的转录组表达的调控.结果 DF组与对照组比较得到530个差异表达基因,其中上调表达有194个,下调表达有336个.GO功能富集结果表明差异表达基因集中于代谢过程、细胞、细胞组分、催化活性等功能;KEGG分析结果表明差异表达基因主要参与代谢途径、次生代谢产物的生物合成、内质网蛋白质加工、氧化磷酸化、RNA转运途径.结论 香鳞毛蕨乙醇提取物的抑菌机制可能与抑制内质网蛋白质加工、氧化磷酸化、RNA转运途径有关.

为对香鳞毛蕨的化学成分进行提取分离及体外抗浅部真菌活性研究.本实验采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20凝胶以及制备液相色谱方法对香鳞毛蕨的化学成分进行分离纯化,得到8个化合物,根据理化性质和波谱数据分析确定所得化合物的结构,分别鉴定为白绵马素PB(1)、绵马素PP(2)、黄绵马酸BB(3)、田基黄绵马酸A(4)、filicinic acid Ⅵ(5)、mallophenone(6)、绵马素AB(7)、绵马酚B(8),其中化合物1～6均为首次从该植物中分离得到,经抗真菌筛选,发现化合物3～8对红色毛癣菌和石膏样小孢子菌具有较好的抑制作用,可为进一步开发其药用价值奠定基础.

目的 探究香鳞毛蕨有效部位乳膏对犬小孢子菌(Microsporum canis)的体内外抗菌作用.方法 采用琼脂扩散法测定药物对抑菌圈直径的影响,试管药基法和微量稀释法测定香鳞毛蕨有效部位对12株M.canis的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC);绘制时间-杀菌曲线,动态评价香鳞毛蕨有效部位对M.canis的杀菌作用.建立M.canis致豚鼠体癣模型,皮肤病变评分、真菌学转阴率、组织病理学三方面综合评价香鳞毛蕨有效部位乳膏对M.canis的体内抗菌作用.结果 香鳞毛蕨有效部位高、中、低剂量对M.canis产生不同大小的抑菌圈.试管药基法和微量稀释法测定香鳞毛蕨有效部位对12株M.canis MIC范围为0.185～1.477 mg/mL和0.157 4～1.26 mg/mL,MFC范围为0.369～2.594 mg/mL和0.472 5～1.89 mg/mL;香鳞毛蕨有效部位高剂量组72 h时呈现明显杀菌作用.与模型组比较,香鳞毛蕨有效部位乳膏第14、21天均可降低豚鼠体癣模型皮损评分(P＜0.05,P＜0.01),给药21 d香鳞毛蕨有效部位乳膏低、中、高剂量转阴率分别为40％、60％、80％,PAS染色结果表明给药14、21 d,香鳞毛蕨有效部位乳膏可减少感染组织皮肤角质层孢子数.结论 香鳞毛蕨有效部位对M.canis有一定体内外抑菌和杀菌作用.

黄绵马酸AB是香鳞毛蕨中具有多种生物活性的双环型间苯三酚衍生物.对黄绵马酸AB采用逆合成分析法进行结构分析,利用拼合原理设计合成了黄绵马酸AB.以间苯三酚为原料,经维尔斯迈尔-哈克反应、还原反应和酰基化反应合成2-甲基-4-丁酰基间苯三酚,经酰基化反应、烷基化反应和脱酰基反应合成绵马酸片段,最后以N,N-二甲基亚甲基碘化铵活化反应得到黄绵马酸AB.中间体和黄绵马酸AB经MS、1H NMR和13C NMR进行结构确证,目标产物总收率达14.7％,设计的黄绵马酸AB合成路线原料易得且操作简便.

为研究阔鳞鳞毛蕨Dryopteris championii的化学成分,本研究利用硅胶、ODS、Sephadex LH-20柱层析及制备型高效液相等色谱分离技术对阔鳞鳞毛蕨地上部分的95％乙醇提取物进行分离纯化,从乙酸乙酯萃取部位分离得到13个黄酮类化合物,并通过现代光谱和文献对比的方法鉴定其结构分别为表儿茶素(1)、木犀草素(2)、柚皮素(3)、圣草酚(4)、槲皮素(5)、芹菜素(6)、山奈酚(7)、黄芪苷(8)、广寄生苷(9)、槲皮素-3-O-β-D葡萄糖苷(10)、牡荆素(11)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(12)、槲皮素-3-0-6-反式-对香豆酰基β-D-葡萄糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷(13),包括1个黄烷醇、2个二氢黄酮、4个黄酮、6个黄酮醇.化合物1～13均为首次从该种植物中分离得到,其中6、8、9、11和13为首次从该属植物分离得到.

DREB (dehydration-responsive element-binding)转录因子是响应非生物胁迫反应的主要调节因子,为探索DREB在多年生草本药用植物香鳞毛蕨[Dryopteris fragrans (L.)Schott]抗逆过程中的功能,该研究克隆了DfDREB基因并进行生物信息学分析,采用qRT-PCR方法分析了DfDREB基因在不同激素及干旱、NaCl、高温和低温等逆境胁迫处理下的表达模式.结果 表明:(1)成功获得DfDREB基因全长1 203 bp,其编码401个氨基酸,相对分子质量为43.66 kD,等电点为6.13,是亲水性非分泌蛋白,该蛋白具有AP2保守结构域,属于AP2家族.(2)实时荧光定量PCR分析表明,DfDREB基因在香鳞毛蕨根、叶柄和叶中均有表达,其中在叶中表达量最高,根中表达量最低;在水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和乙烯利(ETH)处理时,DfDREB基因表达上调,并都在1h时表达量达到峰值;在脱落酸(ABA)处理时,DfDREB基因的相对表达量仅在12 h和24 h时呈上调表达,其余时间为下调表达;在干旱、NaCl和高温处理时,DfDREB基因表达均上调;低温处理0.5h和12 h时DfDREB基因表达显著上调,但在低温处理1～6 h和24 h时无明显变化.研究表明,DfDREB基因响应激素和非生物胁迫处理,且基因表达受胁迫诱导.该研究结果为进一步探索香鳞毛蕨抗逆分子机制奠定了基础.