以先前筛选到的高产漆酶黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)为模板,利用同源克隆技术合成一个全长为1680 bp的漆酶基因,核苷酸及氨基酸序列比对显示该基因与真菌漆酶基因有较高的同源性,将其命名为lac1680,将该基因连接到构建好的pET24a载体上,并转入表达菌株BL21 Escherichia coli(DE3)中,经对重组菌预表达的全菌裂解物进行SDS-PAGE检测,获得75 kD目的条带,表明诱导表达成功.随后利用NI-NTA层析柱对洗脱下来的lac1680蛋白进行纯化,纯化回收后,漆酶纯度可达98％ 以上.通过对比基因工程菌和黄孢原毛平革菌野生菌株不同培养时间产酶活力,结果表明构建好的工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高,提高了近39％.

利用黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因(PcLIPH8),构建植物双元表达载体35S∷PcLIPH8,并遗传转化水稻野生型品种Kitaake,对转基因水稻进行分子鉴定、酶活及木质素含量测定、表型观察等分析.结果表明:(1)成功构建了植物双元表达载体35S∷PcLIPH8,获得3个独立的转PcLIPH8水稻株系,但在苗期转基因水稻与野生型对照无明显表型差异.(2)酶活及木质素含量测定结果表明,转基因水稻的木质素过氧化物酶活性增加3.06％～5.07％,而木质素含量显著低于野生型对照,苗期降低11.44％～14.97％,成熟期降低13.83％～20.05％.(3)成熟期表型分析表明,转基因水稻较野生型对照的株高增加了28.37％～39.78％,穗谷粒数增多110％～120％,生物量增大18.61％～22.97％,而千粒重减小12.86％～13.34％,谷粒长度变短6.67％～7.15％.该研究结果为利用PcLIPH8基因降低木质素含量,提高生物产量,从而改善植物品质奠定了前期基础.

[背景]传统絮凝剂的使用会带来安全和环境污染方面的问题,而微生物絮凝剂具有无毒、无二次污染、易生物降解的优点,因此寻找高效廉价的微生物絮凝剂具有重要意义.[目的]研究黄孢原毛平革菌BKMF-1767产生的胞外多糖絮凝剂的絮凝特性及机理.[方法]使用高岭土进行PCF-1767的絮凝活性测定,分析絮凝剂获取时间、Ca2+浓度、投加量、pH、温度对絮凝效率的影响,并测定PCF-1767的热稳定性.测定絮凝剂的单糖组成、糖苷键连接类型、多糖分子量、Zeta电位变化、对絮体形态观察,探讨了PCF-1767的絮凝机理.[结果]培养6-12 d获得的PCF-1767的絮凝活性良好;7d絮凝剂要获得较好的絮凝效率至少需加入2 mmol/L Ca2+作为助凝剂,最佳投加浓度为0.75-1.35 mg/L,最适pH为3.0-9.0,对温度高于50℃的废水絮凝活性逐渐降低,经过沸水浴处理3h后的絮凝活性几乎不变.PCF-1767中多糖的一级结构主要由葡萄糖以→4)Glup(1→的方式连接,多糖分子量随培养时间的延长而增大,变化范围为9.897×105-2.126×106 Da.结合Zeta电位变化与絮体显微图像分析表明其絮凝机理主要为吸附架桥和卷扫作用,而非电荷中和作用.[结论]PCF-1767具有很高絮凝活性,其用量低、适用条件广、热稳定性高,是一种非常具有应用前景的絮凝剂.

[目的]为了获得高产木素过氧化物酶酿酒酵母工程菌.[方法]本研究从黄孢原毛平革菌中克隆了木素过氧化物酶(lignin peroxidases,LiP)基因,全长2193 bp,编码371个氨基酸,并与来源于酿酒酵母的PGK启动子序列、来源于pPIC9K质粒的α-信号肽序列以及来源于pSH65质粒的CYC1终止子序列通过重叠延伸PCR构建完整表达盒(PαLiC),利用rDNA整合法构建木素过氧化物酶酿酒酵母表达载体,实现木素过氧化物酶在酿酒酵母中的多拷贝表达.利用数字微滴PCR技术对拷贝数进行鉴定,探究拷贝数与蛋白表达量之间的关系.[结果]通过rDNA整合法得到拷贝数为1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13的木素过氧化物酶酿酒酵母工程菌,通过对其酶活测定,表明当拷贝数为7时,酶活力最高,为367 U/L.[结论]本研究在酿酒酵母中表达了木素过氧化物酶,研究了其基因拷贝数与酶活性的关系,对木质素降解技术的发展具有重要意义.

为研究白腐真菌对蒽醌染料的生物降解机制,以白腐真菌黄孢原毛平革菌为脱色降解菌株,分析了蒽醌染料活性艳蓝KN-R(RBBR)的浓度、金属离子及脱色参数对染料脱色的影响;采用紫外-可见光谱、红外光谱、气相色谱-质谱(GC-MS)分析和植物种子毒性实验进行降解产物分析,以揭示RBBR可能的降解路径及其产物的毒性结果表明:在pH 4.2、28℃、5mmol/L的Mn2+条件下,脱色降解200mg/L RBBR,24h脱色率可达95％以上.推测RBBR的降解途径为:RBBR中连接苯环和蒽醌的氮键裂解,产生了1-氨基蒽醌和间-(β-羟乙基砜硫酸酯钠)苯胺.1-氨基蒽醌上的氨基被羟基取代,再经过氧化、脱环、重排产生了邻苯二甲酸,接着邻苯二甲酸氧化开环生成丁二酸;同时,间-(β-羟乙基砜硫酸酯钠)苯胺上的氨基被氧化,生成丁二酸及其他小分子酸、二氧化碳和水.植物种子毒性实验表明,黄孢原毛平革菌对RBBR有较好的脱毒作用.综上,黄孢原毛平革菌能高效降解高浓度的RBBR,同时可显著降低染料对植物的毒害作用.

以选育的抗营养阻遏产木质素降解酶黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)pcR5305、pcR5324为实验对象,研究了其在富氮条件下动态产漆酶同工酶的规律及其可能的营养调控机制.两菌株可在初始氨氮质量浓度达2.2 g/L的富氮环境下产漆酶,启动漆酶合成及达到产酶峰值对应的葡萄糖、氨氮浓度阀值远高于野生型,基质C/N的降低是漆酶合成启动及达到高峰的前提,其中碳浓度的降低更为重要.两菌株在不同时间可产生1～3种漆酶同工酶(分别为Lac1、Lac2和Lac3),其中Lac3产酶伴随菌体整个生长过程,其合成启动与积累无需受基质碳氮饥饿及C/N的限制;Lac2在pcR5305初生代谢阶段产生,但只能在pcR5324次生代谢阶段产生;Lac1仅在pcR5305的初生代谢或次生代谢阶段产生,基质C/N降至5.0～7.0时诱导产生Lac1的合成,并随培养时间的增加产酶量逐渐提高.显然3种同工酶的合成具有不同的调控机制.

以白腐真菌模式菌株黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium为研究对象,探讨培养条件、重金属和芳香族化合物对产漆酶的影响,并进一步研究漆酶对刚果红的降解效果.结果 表明,P.chrysosporium产漆酶最适培养条件:葡萄糖为碳源,蛋白胨为氮源,碳氮比为90.培养8d后,漆酶酶活为911.1U/L;Mn2+严格地控制着P.chrysosporium产漆酶,而Cu2+对其影响不大,在添加4.0mmol/L Mn2+时,漆酶酶活为2001.7U/L;芳香族化合物中藜芦醇(veratryl alcohol,VA)、4-香豆酸、香草醛和香草酸对菌体产漆酶能力均有促进作用,最高可提升至1459.1U/L,而咖啡酸对菌体产漆酶稍有抑制.100U/L漆酶粗酶液可降解40mg/L刚果红,降解率为24.0％;而当介体物质VA存在时,该降解效率可提升至87.7％.

本研究利用愈创木酚和苯胺蓝固体培养基对菌株进行初筛,利用形态学和分子生物学对筛选出的菌株进行鉴定,以黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium CGMCC 5.0776为对照,利用其对玉米秸秆进行预处理并测定木质素和纤维素的降解率,测定筛选菌株在预处理玉米秸秆过程中漆酶、锰过氧化物酶(manganese peroxidase,MnP)和木质素过氧化物酶(lignin peroxidase,LiP)活性.结果表明:利用愈创木酚和苯胺蓝固体培养基,从16株白腐真菌菌株中筛选出2株具有较高漆酶或MnP活性的菌株,鉴定其为桦栓孔菌 Trametes betulina(L.)Pilát(ZT-153)和亚黑管孔菌 Bjerkandera fumosa(Pers.)P.Karst.(ZT-307),测定T.betulina ZT-153和B.fumosa ZT-307对玉米秸秆酸不溶木质素降解效率分别为13.60％和21.87％,较对照P.chrysosporium CGMCC 5.0776高1.58％和9.85％,对纤维素的降解率较低,分别为4.10％和4.50％.2株菌株在预处理玉米秸秆过程中,T.betulinaZT-153表现出漆酶和MnP活性,B.fumosa ZT-307只表现出LiP活性.其中B.fumosa ZT-307对玉米秸秆酸不溶木质素的降解效率最高,在秸秆资源的综合利用方面具有较好的潜力和应用前景.

微生物絮凝剂与传统化学絮凝剂相比,安全无毒、无二次污染,具有开发潜力.黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)能产生微生物絮凝剂,但目前缺少对其产絮凝剂营养条件的优化.使用高岭土并利用单因素法研究碳源、氮源、碳氮比、接种量对Phanerochaete chrysosporium产絮凝剂的产量和絮凝效率的影响,最后对菌体产絮凝剂的营养条件进行优化.结果表明,以葡萄糖为碳源时产生的多糖量(281.3 mg/L)最大,淀粉为碳源时生物量(4.35 g/L)最大,两者作为碳源产生的絮凝剂絮凝效率分别为65％和43％;硝酸铵作为氮源时产生的多糖量(163.61 mg/L)最大,且其产生的絮凝剂絮凝效率为82.5％;碳氮比在60～100时有利于絮凝剂的产生,当其为90时絮凝效率达到(80.5％)最大;接种量在0.25％ ～1％时生物量相差不大,接种1％时产生的多糖量为155.57 mg/L,絮凝效率达到(87.14％)最大.综上,最佳营养条件是以葡萄糖为碳源,硝酸铵为氮源,碳氮比为90,接种量为1％,这为大规模生产絮凝剂奠定了基础.

目的 分析类风湿性关节炎(RA)患者肠道真菌菌群多样性变化.方法 纳入RA患者30例,健康体检者31例.采用ITS2高通量测序法测定RA患者与健康体检者共61例粪便样本的真菌构成.通过Alpha与Beta多样性、t检验及LEfSe分析比较2组间的真菌物种组成及差异.结果 RA患者肠道中假丝酵母菌属(Candida)的丰度有所上升,并富集节担菌属(Wallemia)、黄孢原毛平革菌属(Phan-erochaete)、Suhomyces、弯颈霉属(Tolypocladium)、共球藻属(Trebouxia)、银耳属(Tremella)、Scolecostigmina属及帚枝霉属(Sarocladium).结论 RA患者的肠道真菌菌群多样性没有发生显著改变,但其菌群结构发牛改变,这些改变可能与RA的发生相关.