目的:阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea and hypopnea syndrome, OSAHS)是一种睡眠疾病，对体内代谢有多方面的影响，生物标志物研究成为热点和方向。但是很多蛋白表达本身存在昼夜变化，本研究拟对早晚采样时间点蛋白差异变化进行探索性研究。方法:研究对象是经整夜睡眠监测确定为非OSAHS的无鼾成年男性28例。采集整夜睡眠监测前后的早晚唾液样本。每份唾液样本中都加入内参蛋白(牛胎球蛋白和酿酒酵母乙醇脱氢酶)，同步进行平行反应监测(parallel reaction monitoring，PRM)，通过靶向蛋白质组学方法定量分析98种与OSAHS相关的唾液蛋白。结果:唾液蛋白的个体差异较大，总计平均变异系数为95.9%，其95%置信区间为(84.7%，107.2%)。以差异倍数>2倍且 P<0.05的标准筛选早晚差异表达蛋白，得到早晨表达上调蛋白有13个，未见下调蛋白，表达无差异蛋白72个。无表达差异蛋白主要为细胞骨架蛋白及相关结合蛋白、氧化应激相关蛋白、免疫炎症相关蛋白和代谢相关蛋白等。表达差异蛋白功能涉及方面较广，包括机体免疫、血管生成、物质与能量代谢、神经发育和钙离子结合等。 结论:本研究发现部分唾液蛋白存在早晚明显差异，提示无鼾正常男性部分唾液蛋白的昼夜节律性变化。研究OSAHS患者生物标志物时，应考虑部分唾液蛋白固有的昼夜节律特性，规定时间段采样，并推荐早晚都进行采样。

目的:探究白念珠菌anillin家族蛋白Int1对septin细胞骨架组织的调控。方法:构建白念珠菌Int1蛋白的全长及截短的系列片段质粒，使其与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达，通过荧光显微镜观察其胞内定位，鉴定Int1中介导芽颈定位的区域。在模式生物酿酒酵母细胞中，对Int1全长及片段进行过量表达，观察其对细胞生长、细胞形态和septin组织的影响，从而确定Int1中介导与septin相互作用，发挥主要生物学效应的功能区段，研究这一区段与septin的共定位。结果:Int1全长1 661个氨基酸残基，鉴定出一段仅含有209个氨基酸的中间区段Int1-M4(739~947 aa)，在小芽和大芽时期均可以定位在芽颈。过量表达Int1-M4导致细胞产生显著的生长缺陷、芽体变长的细胞形态和septin组织絮乱。在芽体变长的细胞中，Int1-M4与异常的septin结构存在明显共定位。结论:Int1中一段仅含有209个氨基酸的中间区段Int1-M4(739~947 aa)介导了其芽颈定位和与septin的相互作用，在调控septin组织过程中发挥重要功能。

目的:探讨不同血清学标志物在炎症性肠病（IBD）中的诊断价值，并分析其与疾病表型的关联。方法:回顾性收集2010年6月至2020年12月北京协和医院445例IBD患者的临床资料，其中溃疡性结肠炎（UC）223例［男111例，女112例，年龄46（20，79）岁］，克罗恩病（CD）222例［男147例，女75例，年龄39（19，72）岁］。分别分析两组患者血清抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）、抗酿酒酵母抗体（ASCA）、抗杯状细胞抗体（GAB）、抗胰腺腺泡抗体（PAB）的阳性率；计算不同组合抗体诊断UC和CD的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值；通过logistic回归分析不同组合抗体与疾病表型的关联。结果:CD患者血清ASCA、PAB阳性率分别为34.7%（77/222）、38.3%（85/222），均高于UC患者的10.3%（23/223）、4.5%（10/223）（均 P<0.001）。UC患者血清ANCA阳性率为50.2%（112/223），高于CD患者的5.4%（12/222）（ P<0.001）。CD和UC患者血清GAB阳性率分别为21.6%（48/222）、28.3%（63/223），差异无统计学意义（ P=0.760）。单项ASCA（+）、双联ASCA（+）ANCA（-）、四联ASCA（+）ANCA（-）PAB（+）GAB（-）诊断CD的灵敏度分别为34.7%、32.9%、20.7%，特异度分别为89.7%、95.5%、100.0%，阳性预测值分别为77.0%、90.1%、100.0%，阴性预测值分别为58.0%、58.7%、55.9%；单项ANCA（+）、双联ANCA（+）ASCA（-）、四联ANCA（+）ASCA（-）PAB（-）GAB（+）诊断UC的灵敏度分别为50.2%、40.4%、24.2%，特异度分别为94.6%、95.5%、100.0%，阳性预测值分别为90.3%、90.0%、100.0%，阴性预测值分别为65.4%、61.4%、56.8%。单项ASCA（+）（ OR=3.39，95% CI：1.59~7.21）、双联ASCA（+）ANCA（-）（ OR=2.87，95% CI：1.34~6.14）、三联ASCA（+）ANCA（-）GAB（-）（ OR=3.09，95% CI：1.31~7.31）和四联标志物ASCA（+）ANCA（-）PAB（+）GAB（-）（ OR=3.15，95% CI：1.56~8.03）与狭窄型和（或）穿通型CD有关联；而单项标志物ANCA（+）（ OR=2.69，95% CI：1.42~5.12）、双联ANCA（+）ASCA（-）（ OR=2.11，95% CI：1.03~4.16）与UC广泛结肠病变有关联。 结论:以ASCA或ANCA为基础，联合PAB或GAB检测有助于IBD诊断，且与狭窄型和（或）穿通型CD、广泛结肠型UC有关联。

视黄醇是维生素A的主要活性形式之一,对于机体的生长发育、眼部和皮肤功能维持至关重要,被广泛应用于化妆品、医药和饲料添加领域.动物体内不具备完整的维生素A合成途径,但可通过膳食直接摄入或将膳食中获得的β-胡萝卜素转化获得.为了推进视黄醇的生物法合成研究,首先以β-胡萝卜素合成平台CAR?1 为基础,筛选了 3 种不同来源的醇脱氢酶,确定了大肠杆菌来源的ybbO具有最高的催化活性,转化率可达 95.6%.为了进一步提高反应速率和产量,采用蛋白质融合技术将视黄醇合成模块中 2 个相邻酶blh和ybbO进行融合后,在高产β-胡萝卜素工程菌株CAR?3 中进行评估,获得了最优组合blh-GGGS-ybbO,其产量较融合前提高了 44.9%,达到(111.1±3.5)mg·L-1.进一步工作中,通过引入人源的视黄醇结合蛋白(RBP4)以及转甲状腺素蛋白(TTR),在酿酒酵母中模拟了人体肝脏细胞分泌视黄醇的过程,视黄醇产量增加至(158.0±13.1)mg·L-1.最后,采用过表达INO2 扩张β-胡萝卜素合成途径反应区室,提高血红蛋白VHb表达量以增强氧气的供给,强化PDR3m表达促进视黄醇的转运和开发 2 个阶段发酵工艺等方法,在 5 L发酵罐中成功将视黄醇的产量提升至(2 320.0±26.0)mg·L-1,为视黄醇产业化发展提供了重要基础.

[目的]为实现生物合成重要化合物 2-萘乙醇,探索利于 2-萘乙醇合成的基因组合.[方法]向酿酒酵母BY4741发酵液中外源添加 2-萘丙氨酸,运用高效液相色谱法进行产物检测;绘制BY4741 的生长曲线和产量曲线,添加不同浓度 2-萘丙氨酸到BY4741 发酵液中并检测BY4741 生长和生产情况;对BY4741 进行代谢工程改造,构建过表达Ehrlich途径 6 个基因的质粒并转化进BY4741 中;发酵 6 株改造菌株,检测产物产量.[结果]发酵液中检测到了推测产物 2-萘乙醇,代谢工程改造菌株相较于野生型BY4741 菌株产量均有所提升,其中过表达ARO9和ARO10基因使得 2-萘乙醇的产量在外源添加 1 mmol/L 2-萘丙氨酸的情况下达到 0.258 mmol/L,转化率达到野生型的 2.3 倍.[结论]在酿酒酵母中实现了 2-萘乙醇的生物合成,探索出ARO9 和ARO10 是利于 2-萘乙醇生物合成的基因组合,为工业生产 2-萘乙醇提供了一种新的生物合成方法.

熊果酸近年来由于其独特的药理活性以及宝贵的市场价值,逐渐引起人们的广泛关注.目前熊果酸大多从枇杷叶中提取,但植物提取法产率低,成本高,化学合成法又不易获得,因此生物合成法为熊果酸提供了一个新的来源.α-amyrin作为合成熊果酸的主要前体物质,其产量与熊果酸产量呈正相关性.氧化鲨烯环化酶(OSC)属于多基因家族,可以催化常见的前体 2,3-氧化鲨烯生成多种不同类型的三萜骨架,为三萜类物质的合成起决定性作用.但药用植物中催化合成α-amyrin的关键基因报道较少,且其催化产物中α-amyrin产量及占比一直是研究者们关注的重点.该文从鸢尾、苹果、青蒿和长春花中克隆出能够催化 2,3-氧化鲨烯生成α-amyrin的 4 种环化酶ItOSC2、MdOSC1、AaOSC2 和CrAS基因,系统地对 4 种环化酶进行序列比对以及进化树分析,并以质粒形式将其转化至酿酒酵母中进行异源表达.发酵 7 d后测定其催化产物中α-amyrin、β-amyrin以及麦角固醇的产量及占比,筛选出一个催化生成α-amyrin能力最好的AaOSC2,为后期构建高产α-amyrin及熊果酸的工程酵母菌株提供关键基因元件.

CRISPR/Cas9系统已广泛用于各种生物体的基因编辑和代谢工程.本文综述了CRISPR/Cas9在酿酒酵母中的基本原理和实际应用.首先总结了CRISPR/Cas9技术的发展历史、酿酒酵母基因组中基因缺失和多DNA片段插入的成功案例.这一先进的系统减少了劳动力,增强了对分子遗传学的理解,加速了微生物工程的发展.其次总结了基于CRISPR/Cas9的系统在生产高附加值化学品和提高酿酒酵母耐应激性方面的研究进展.该综述对酿酒酵母的遗传和合成生物学研究具有重要的参考价值.

[目的]为解析甘蔗基因组的密码子使用特征,提高异源基因在甘蔗中的表达效率.[方法]以已发布的甘蔗属种(热带种LA-purple、割手密NP-X和AP85-441)及其近缘属种蔗茅(Yunnan2009-3)基因组为数据,利用Python、CodonW1.4.2 进行密码子偏好性分析,同时通过中性绘图、ENC-plot、PR2-plot等分析探讨密码子偏好性形成的影响因素,并结合转录组测序数据分析密码子偏好性参数与基因表达水平的相关性.最后,基于RSCU均值与 7 个主要模式生物种(玉米、高粱、水稻、拟南芥、烟草、大肠杆菌、酿酒酵母)的密码子使用模式进行比较分析.[结果]显示热带种、割手密和蔗茅的基因组都富含GC,平均GC含量为 56.3%,且GC3>GC1>GC2,倾向于使用以G/C结尾的密码子,平均ENC值为 48.45,偏好性较低.中性绘图、ENC-plot和PR2-plot分析表明它们的密码子偏好性受到自然选择、突变压力等多种因素的共同影响,其中自然选择占主导作用.相关性分析表明密码子偏好性参数与基因实际的转录表达水平存在显著相关性,但相关性不强.根据RSCU和?RSCU值,确定了 13 个最优密码子,均以C或G结尾,密码子使用特性在全基因组和染色体组水平上无差异.通过比较发现,甘蔗的核苷酸组成及密码子偏好性与玉米、高粱和水稻较为相似,而与拟南芥、烟草、大肠杆菌和酵母具有显著差异.[结论]甘蔗热带种、割手密和蔗茅的密码子偏好性高度相似,其形成受自然选择和突变因素的影响.此外,对甘蔗优异基因功能异源验证时可优先选择玉米、水稻和高粱作为异源表达系统.

[目的]脂肪酸转运蛋白(FAX)可介导植物细胞内脂肪酸从质体向外运输,在植物生长发育及响应非生物胁迫等方面发挥重要作用.研究陆地棉FAX家族基因及功能分析,为明确陆地棉油脂积累的分子机制和油脂代谢工程提供新思路.[方法]从全基因组水平对GhFAX基因家族进行鉴定,并对GhFAX1 蛋白进行亚细胞定位,通过酵母与烟草遗传转化对GhFAX1进行功能验证.[结果]在陆地棉基因组中共鉴定到 12 个GhFAXs基因,家族各成员间具有相似的基因结构及蛋白理化性质.序列比对分析发现,GhFAX蛋白仅有少数氨基酸在进化中高度保守,暗示其对功能的重要性;进化树分析表明,GhFAXs基因与亚洲棉、雷蒙德氏棉的亲缘关系较近.转录组数据表明,GhFAXs可能参与陆地棉响应逆境胁迫的调控过程.通过实时荧光定量PCR发现,GhFAX4 在花中表达较高,说明其参与花粉发育过程;GhFAX9 在茎中表达较高,GhFAX1 在陆地棉各个组织表达量均较高.选择GhFAX1进行亚细胞定位分析,证实GhFAX1定位在质体中.构建GhFAX1载体,使GhFAX1在酿酒酵母中过表达,结果显示,GhFAX1 过表达酵母总脂提高了 3.53%.底物偏好性试验显示,GhFAX1 对C16:0 具有选择性.通过烟草遗传转化,培育GhFAX1过表达烟草.结果显示,过表达烟草叶绿素提升了 13.24%,荧光参数NPQ提高 14.17%,Fm提高 34.94%,F0 降低 35.28%;叶片总脂肪酸提高了 5.2%,种子总脂肪酸提高了 6.52%;种子的千粒重增加了近 19.1%;同时蛋白含量显著下降.[结论]GhFAXs提高了酵母与烟草的含油量,参与质体中棕榈酸的转出,使蛋白合成途径上的碳源流向油脂合成途径.

目的:从中华大蟾蜍(Bufo gargarizans Cantor)肝脏组织中克隆细胞色素P450还原酶基因(BgCPR,GenBank登录号:OQ572435)进行生物信息学分析,并进行功能验证.方法:基于中华大蟾蜍转录组数据库挖掘BgCPR基因序列,使用SnapGene软件设计BgCPR基因两端特异性引物,以蟾蜍肝脏组织总RNA逆转录成的cDNA为模板进行PCR扩增.利用生物信息学分析BgCPR蛋白理化性质、空间结构并构建系统进化树;基于CRISPR/Cas9基因编辑系统将蟾蜍BgCPR基因表达框经同源重组整合进入酿酒酵母基因组,利用聚乙二醇法制备转化子微粒体,验证其对细胞色素C的还原功能.结果:克隆得到全长2 043 bp的BgCPR基因cDNA,编码680个氨基酸,相对分子质量77 852 Da.结构预测显示,BgCPR蛋白为非分泌蛋白;有一段跨膜螺旋区,位于蛋白的第24～46位氨基酸之间;亚细胞定位预测显示该蛋白定位于内质网上.采用体外酶活实验证明其具有传递电子功能.结论:本研究克隆得到中华大蟾蜍BgCPR基因,并构建了表达具有生物活性的BgCPR的酿酒酵母工程细胞,为进一步研究蟾蜍CYP450基因功能乃至解析蟾蜍二烯内酯类化合物的生物合成途径奠定了基础.