目的:探究龙牙楤木总皂苷对AMPK/Nrf2 信号通路的影响.方法:将人心肌细胞AC16 进行体外培养,分为空白对照组、缺氧/复氧模型组、铁离子螯合剂对照组,铁离子螯合剂组、龙牙楤木总皂苷低(0.02 μg/mL)浓度组、龙牙楤木总皂苷中(0.1 μg/mL)浓度组、龙牙楤木总皂苷高(0.5 μg/mL)浓度组,丹参滴丸(50 μg/mL)阳性对照组,AMPK抑制剂Compound C(5 μg/mL)+龙牙楤木总皂苷组,Nrf2 抑制剂ML385(2 μg/mL)+龙牙楤木总皂苷(0.5 μg/mL)组.MTT法检测细胞存活率;试剂盒检测细胞内Fe2+、ROS水平;免疫荧光法检测脂质过氧化物及GPX4、ACSL蛋白表达水平;qRT-PCR检测 GPX4、ACSL4 mRNA表达,Western Blot检测 GPX4、ACSL4、p-AMPK、Nrf2 蛋白表达;结果:与空白对照组比较,模型组细胞存活率、GPX4 mRNA表达显著降低,Fe2+含量、ROS和脂质过氧化水平、ACSL4 mRNA表达显著升高,p-AMPK、Nrf2 蛋白表达显著降低(P<0.01).与模型组比较,铁离子螯合剂组细胞存活率、GPX4 mRNA表达显著升高,Fe2+、ROS、脂质过氧化水平及ACSL4 mRNA表达显著降低(P<0.01);龙牙楤木总皂苷各组和丹参滴丸组细胞存活率及GPX4、p-AMPK、Nrf2 蛋白表达显著升高,心肌细胞中Fe2+、ROS、脂质过氧化水平及ACSL4 蛋白表达显著降低(P<0.05 或P<0.01).与龙牙楤木总皂苷组比较,Compound C+龙牙楤木总皂苷组和ML385+龙牙楤木总皂苷组细胞存活率显著降低,Fe2+含量显著升高,Nrf2 蛋白表达显著降低,Compound C+龙牙楤木总皂苷组ROS和脂质过氧化水平显著升高,p-AMPK蛋白表达显著降低(P<0.05 或 P<0.01).结论:龙牙楤木总皂苷可通过激活AMPK/Nrf2 信号通路,抑制H/R诱导的心肌细胞铁死亡.

目的 探讨龙牙楤木总皂苷对离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制.方法 利用Langendorff离体心脏灌流装置,通过结扎左冠状动脉前降支30分钟,复灌75分钟,构建离体大鼠心脏缺血再灌注模型,将48只大鼠随机分为4组:假手术组、模型组、MCC950组、龙牙组,利用多导生理仪记录全程心率(heart rate,HR)、左心室发展压(left ventricular developed pressure,LVDP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtMax)、左心室内压最大下降速率(-dp/dtMax)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色观察梗死面积、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察心肌组织病理改变、采用酶联免疫法(ELISA)检测灌流液中肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量.结果 与假手术组比较,模型组再灌注时出现明显的心率失常,且出现灰白色梗死区;与模型组比较,假手术组、龙牙组、MCC950组各时刻心率无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),龙牙组、MCC950组可明显升高再灌注时LVDP、±dp/dtMax,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,龙牙组、MCC950组可减少心肌细胞破碎、心肌纤维断裂和炎性细胞浸润,明显降低再灌注时灌流液中心肌酶CK、LDH、MDA的含量,升高SOD的含量.结论 龙牙楤木总皂苷可通过抑制NLRP3炎症小体途径发挥抗心肌缺血再灌注损伤的作用.

去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa(deglucosechikusetsusaponinⅣa,DCⅣa),即齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷,是从东北药材五加科植物龙牙楤木(Aralia elata)的总皂苷中通过大孔树脂分离纯化并结合化学转化的方法得到的生物活性成分,纯度达98％,工艺稳定.本实验室前期研究证明,口服给药具有较明显的抗心律失常作用,具有一定的心肌细胞保护作用;体内实验显示可抑制氯化钡、乌头碱、毒毛花苷G及结扎左冠状动脉前降支诱发大鼠或豚鼠心律失常[1];体外试验证明DCⅣa还可通过对心肌细胞钠、钾和钙离子通道的作用影响心肌细胞的兴奋性和收缩力,能够有效降低心肌自律性和兴奋性[2-4].此外对缺氧复给氧的心肌细胞具有保护作用[5].

目的:从NLRP3炎症小体途径探讨龙牙楤木总皂苷抗心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的作用机制.方法:将48只大鼠随机分为4组:假手术组、模型组、MCC950组、龙牙组,采用Langendorff离体心脏灌流装置,通过结扎左冠状动脉前降支30min,复灌75min,构建大鼠离体心脏MIRI模型,假手术组只穿线不结扎,余操作同模型组.采用Western Blot检测心肌组织中核苷酸结合寡聚化结构于样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关的斑点样蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-1)表达水平,免疫组化法检测心肌白介素-18 (IL-18)、白介素-1β (IL-1β)蛋白表达水平.结果:与假手术组比较,模型组NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表达水平显著增加(P＜ 0.01);与模型组比较,MCC950组、龙牙组可显著降低NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表达水平(P＜0.01).结论:龙牙楤木总皂苷抗MIRI的作用机制可能与降低炎症、抑制NLRP3炎症小体活化有关.

目的 探讨龙牙楤木总皂苷及其组分楤木皂苷A能否减轻缺氧/复氧诱导的AC16心肌细胞铁死亡.方法 将AC16细胞随机分为正常组、模型组、龙牙楤木总皂苷组、楤木皂苷A组.通过缺氧24小时、复氧12小时建立AC16细胞缺氧/复氧模型,药物组缺氧/复氧损伤前6小时给予药物处理.CCK-8检测细胞存活率,乳酸脱氢酶检测试剂盒检测细胞受损程度,透射电子显微镜观察AC16细胞形态学变化,比色法检测Fe2+水平,酶联免疫试剂盒检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平,DHE荧光探针检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,蛋白免疫印迹法检测铁死亡相关蛋白p53、SLC7A11、SAT1、GLS2的表达.结果 与正常组相比,模型组AC16细胞存活率明显下降,细胞受损程度明显升高,细胞内的线粒体皱缩、内嵴增厚、膜电子密度增高,Fe2+、ROS、MDA水平明显上升,GSH活力明显下降,铁死亡相关蛋白p53、SAT1、GLS2蛋白表达明显升高,SLC7A11蛋白表达明显降低,以上结果差异均具有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,龙牙楤木总皂苷组及楤木皂苷A组AC16细胞存活率明显上升,细胞受损程度明显降低,细胞内的线粒体形态趋于正常状态,Fe2+、ROS、MDA水平下降,GSH活力升高,铁死亡相关蛋白p53、SAT1、GLS2蛋白表达下调,SLC7A11蛋白表达上调,以上结果差异均具有统计学意义(P<0.05).结论 龙牙楤木总皂苷及其组分楤木皂苷A能减轻缺氧/复氧诱导的AC16心肌细胞铁死亡,其机制可能与抑制p53、SAT1、GLS2蛋白表达,上调SLC7A11蛋白表达有关.

目的 基于NR3C1/p53/SLC7A11通路观察龙牙楤木总皂苷(As)及其成分楤木皂苷A(As A)对缺氧/复氧(H/R)诱导的AC16心肌细胞铁死亡的影响.方法 通过缺氧24 h/复氧12 h建立AC16细胞H/R损伤模型,采用细胞转染法调控NR3C1表达,将细胞分为正常组、H/R组、As组(As+H/R)、As A组(As A+H/R)、过表达空载体组(过表达空载体+H/R)、NR3C1过表达组(NR3C1过表达+H/R)、沉默对照组(si-NC+As+H/R)和NR3C1沉默组(si-NR3C1+As+H/R),分别进行相应干预,荧光探针检测活性氧(ROS)水平,ELISA检测丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量,Western blot检测NR3C1、p53和SLC7A11蛋白表达,免疫荧光染色检测NR3C1和p53蛋白表达.结果 与正常组比较,H/R组AC16细胞ROS和MDA水平明显升高,GSH水平明显降低(P<0.05),NR3C1和SLC7A11蛋白表达明显降低,p53蛋白表达明显升高(P<0.05);与H/R组比较,As组、As A组和NR3C1过表达组AC16细胞ROS和MDA水平明显降低,GSH水平明显升高(P<0.05),NR3C1和SLC7A11蛋白表达明显升高,p53蛋白表达明显降低(P<0.05);与过表达空载体组比较,As组和NR3C1过表达组AC16细胞ROS和MDA水平明显降低,GSH水平明显升高(P<0.05),NR3C1和SLC7A11蛋白表达明显升高,p53蛋白表达明显降低(P<0.05);与As组及沉默对照组比较,NR3C1沉默组AC16细胞ROS、MDA水平明显升高,GSH水平明显降低(P<0.05),NR3C1和SLC7A11蛋白表达明显降低,p53蛋白表达明显升高(P<0.05).结论 As及As A可能通过上调NR3C1、SLC7A11蛋白表达,下调p53蛋白表达,抑制H/R诱导的AC16心肌细胞铁死亡.

目的:基于磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路调控核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体途径探讨龙牙楤木总皂苷抗心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的作用机制.方法:将60只大鼠随机分为5组:假手术组、模型组、龙牙楤木总皂苷组、龙牙楤木总皂苷+LY29004组、LY29004组,每组12只.采用Langendorff离体心脏灌流装置,通过结扎左冠状动脉前降支30 min,复灌75 min,构建大鼠离体心脏MIRI模型,假手术组只穿线不结扎,余操作同模型组.采用Western Blot检测心肌组织中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素18(IL-18)蛋白的表达含量,运用实时荧光定量PCR测NLRP3炎症小体组成基因NLRP3、凋亡相关点样蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬酶1(caspase-1)mRNA表达.结果:与假手术组比较,模型组心肌组织中IL-1β、IL-18、ASC mRNA、NLRP3 mRNA、caspase-1 mRNA表达均显著升高(P＜0.01).与模型组比较,龙牙楤木总皂苷组IL-1 β、IL-18显著下降(P＜0.01,P＜0.05),NLRP3 mRNA、caspase-1 mRNA、ASC mRNA表达亦显著下降(P＜0.01);龙牙楤木总皂苷组较龙牙楤木总皂苷+LY29004组IL-1β、IL-18、NLRP3 mRNA、ASC mRNA、caspase-1 mRNA均显著降低(P＜0.05,P＜0.01).结论:龙牙楤木总皂苷可以通过调控PI3K/AKT信号通路,使心肌组织中IL-1β和IL-18降低,使NLRP炎症小体组成基因NLRP3、ASC和caspase-1的基因表达下降,表明龙牙楤木总皂苷有抗MIRI的作用.

目的 探讨龙牙楤木总皂苷(Aralosides)通过调控miR-149-5p对高糖诱导的MIN6 细胞损伤的影响及机制研究.方法 体外培养小鼠胰岛素瘤细胞MIN6,采用浓度为 25 mmol/L葡萄糖诱导建立细胞模型,将细胞分为对照(Control)组、高糖(HG)组、高糖+龙牙楤木总皂苷低、中、高剂量(HG+Aralosides-L、HG+Aralosides-M、HG+Aralosides-H)组、高糖+miR-NC(HG+miR-NC)组、高糖+miR-149-5p(HG+miR-149-5p)组、高糖+龙牙楤木总皂+anti-miR-NC(HG+Aralosides+anti-miR-NC)组和高糖+龙牙楤木总皂+anti-miR-149-5p(HG+Aralosides+anti-miR-149-5p)组.通过CCK8 检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;Western印迹检测B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2 相关X蛋白(Bax)蛋白表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量;定量反转录(qRT)-聚合酶链反应(PCR)检测miR-149-5p表达.结果 与Control组相比,HG组明显降低细胞活力、Bcl-2 蛋白表达、SOD活性、GSH-Px活性、miR-149-5p表达,增加细胞凋亡率、Bax蛋白表达、MDA含量(均P<0.05).与HG组相比,HG+Aralosides-L组、HG+Aralosides-M组、HG+Aralosides-H组明显增加细胞活力、Bcl-2 蛋白表达、SOD活性、GSH-Px活性、miR-149-5p表达,明显降低细胞凋亡率、Bax蛋白表达、MDA含量(均P<0.05).与 HG+miR-NC组相比,HG+miR-149-5p组明显增加细胞活力、Bcl-2 蛋白表达、SOD活性、GSH-Px活性、miR-149-5p表达,明显降低细胞凋亡率、Bax蛋白表达、MDA含量(均P<0.05).与HG+Aralosides+anti-miR-NC组相比,HG+Aralosides+anti-miR-149-5p组明显降低细胞活力、Bcl-2 蛋白表达、SOD活性、GSH-Px活性、miR-149-5p表达,明显增加细胞凋亡率、Bax蛋白表达、MDA含量(均P<0.05).结论 龙牙楤木总皂苷通过调控miR-149-5p减缓高糖诱导的MIN6细胞的凋亡和氧化应激,并促进细胞的增殖.

目的 基于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路探讨龙牙楤木总皂苷抗心肌缺血再灌注损伤的机制.方法 将60只大鼠随机分为假手术组、模型组、龙牙楤木总皂苷组、LY29004组、LY29004+龙牙楤木总皂苷组,每组10只.除假手术组外,其余组利用Lange-ndorff离体心脏灌流装置,通过结扎左冠状动脉前降支30 min、复灌75 min的方法构建离体大鼠心脏再灌注模型.模型组采用K-H液恒速灌流;龙牙楤木总皂苷组和LY29004组分别采用含5 mg/L龙牙楤木总皂苷的K-H液和含15μmol/L LY29004的K-H液恒速灌流;LY29004+龙牙楤木总皂苷组先给予含15μmol/L LY29004的K-H液灌流15 min,再以含5 mg/L龙牙楤木总皂苷的K-H液灌流60 min.采用Western blot法检测心肌组织中PI3 K/Akt信号通路相关蛋白[Akt、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化糖原合酶激酶3β(p-GSK-3β)]表达情况,免疫组化法检测心肌组织中凋亡相关蛋白[半胱氨酸天门冬氨酸酶3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)、Bcl-2关联蛋白X(Bax)]表达情况,HE染色观察心肌组织病理形态.结果 模型组、龙牙楤木总皂苷组、LY29004组、LY29004+龙牙楤木总皂苷组Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白相对表达量和Caspase-3、Bax蛋白阳性表达面积均明显高于假手术组(P均<0.05),Bcl-2阳性表达面积均明显低于假手术组(P均<0.05);龙牙楤木总皂苷组Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白相对表达量和Bcl-2阳性表达面积均明显高于模型组、LY29004组和LY29004+龙牙楤木总皂苷组(P均<0.05),Caspase-3、Bax蛋白阳性表达面积均明显低于模型组、LY29004组和LY29004+龙牙楤木总皂苷组(P均<0.05).假手术组心肌细胞排列有序,未见变性、坏死及炎性细胞浸润;模型组大量心肌细胞变性、坏死及炎性细胞浸润;龙牙楤木总皂苷组心肌细胞轻度肿胀,少量细胞变性、坏死,少量炎性细胞浸润;LY29004+龙牙楤木总皂苷组大量心肌细胞坏死和炎性细胞浸润.结论 龙牙楤木总皂苷可能通过激活PI3 K/Akt信号通路,上调抗凋亡蛋白表达和下调促凋亡蛋白表达而减轻心肌缺血再灌注损伤.