以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)等为原料,来源于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的ATP硫酸化酶(ATPS)和来源于产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)的APS激酶(APSK)构建的多酶催化体系可合成3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS).同时,在酶法合成PAPS的反应体系中引入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的无机焦磷酸水解酶(PPase),消耗反应过程中的副产物PPi,使得反应向生成PAPS的方向进行,大幅提高多酶法合成PAPS的产率.本研究构建了重组质粒pET-28a-sumo-ATPS、pET-28a-APSK和pET-28a-PPase,并在大肠杆菌中表达了重组酶,研究酶学性质和优化多酶催化反应合成PAPS的反应条件,以提高PAPS的产量水平,最终PAPS的累积量为14.47 g/L.该工艺可大幅降低PAPS的制备成本.

目的:探究3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸盐合酶2（PAPSS2）在胃癌组织和细胞中的表达情况及其对胃癌细胞侵袭和迁移的影响。方法:利用GEPIA数据库分析PAPSS2在胃癌组织中的表达情况。收集陕西省人民医院2016年10月至2018年6月40例胃癌手术患者的癌组织及癌旁正常组织标本，进一步通过免疫组织化学染色进行验证。分析PAPSS2表达与胃癌患者临床病理资料和预后的关系。利用qPCR和免疫印迹法分别检测PAPSS2在胃癌细胞（HGC-27、SNU-1、AGS、SGC-7901）和正常胃黏膜细胞系（GES-1）的mRNA和蛋白水平表达差异。利用shRNA敲低胃癌细胞PAPSS2的表达，MTT检测其对细胞活性的影响，Transwell检测其对侵袭和迁移能力的影响。结果:（1）利用GEPIA数据库分析发现，PAPSS2在胃癌组织中高表达（P<0.05），且高表达PAPSS2的胃癌患者总体生存率（HR=1.5，P=0.017）和无病生存率（HR=1.6，P=0.014）显著降低。（2）PAPSS2在40例胃癌组织的免疫组织化学染色评分显著高于对应的癌旁组织（7.100±3.169 vs 3.425±2.263，P<0.001）。高表达PAPSS2的胃癌患者肿瘤浸润深度（P=0.015）和淋巴转移率更高（P=0.005）。（3）qPCR显示PAPSS2在胃癌细胞（AGS、HGC-27、SNU-1、SGC-7901）的mRNA表达水平明显高于GES-1细胞（F=15.45，P<0.001），免疫印迹法也得出了类似的结果。（4）MTT实验发现敲低PAPSS2对AGS和SGC-7901细胞的活性没有明显影响。（5）敲低PAPSS2后AGS细胞（386.9±73.75 vs 602.7±79.23，t=4.457，P=0.002）和SGC-7901细胞（237.8±77.60 vs 461.8±86.55，t=4.309，P=0.003）的迁移能力显著降低，AGS细胞（106.0±38.07 vs 201.3±48.79，t=3.446，P=0.009）和SGC-7901细胞（55.0±18.27 vs 93.6±21.07，t=3.093，P=0.015）的侵袭能力也明显降低。结论:PAPSS2在胃癌组织和细胞中呈高表达，其高表达促进了胃癌细胞的侵袭和转移，这可能是胃癌预后较差的重要原因之一。

硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是一种线性多糖,广泛应用于医疗和保健等领域.相比于传统动物组织提取法,微生物合成硫酸软骨素具有可控、易规模化放大等优势.为实现硫酸软骨素A(CSA)的高效合成,本研究首先通过整合软骨素合酶编码基因kfoC、kfoA以及UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因tuaD至毕赤酵母GS115基因组中,构建了以甘油为唯一碳源发酵生产软骨素的毕赤酵母工程菌株.通过进一步优化软骨素合成途径,软骨素分批补料发酵水平达到2.6 g/L.在进一步整合表达软骨素-4-O-磺基转移酶的基础上,本研究通过向生产软骨素毕赤酵母工程菌株破碎液中添加3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸和软骨素-4-O-磺基转移酶,成功建立了 CSA的一锅法生物合成体系.通过优化,最终实现0-40％不同磺酸化水平CSA的可控合成.本研究中CSA的一锅法生物合成体系操作简便、易放大,更适用于工业化大规模生产.本研究结果也为肝素等其他糖胺聚糖的合成提供了思路.