目的:探究LiaSR双组分信号转导系统对变异链球菌（Sm）593号（Sm 593）临床株耐酸和生物膜形成的影响及相关机制。方法:以Sm 593及其liaS和liaR基因敲除株为研究菌株，采用全自动生长曲线测定仪检测并绘制pH=5.5环境中各菌株的生长曲线；用菌落计数法检测细菌的适应性耐酸能力；使用Laurdan探针、氢-钾腺苷三磷酸（ATP）酶试剂盒、质子通透性检测实验和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）探究LiaSR双组分信号转导系统介导的耐酸机制。体外构建各菌株的生物膜，通过结晶紫染色法、菌落计数法、SYTOX探针检测法和蒽酮-硫酸法探究各菌株的生物膜总量、活菌数、胞外DNA（eDNA）和胞外多糖含量；采用RT-qPCR法检测胞外多糖合成相关基因的表达情况。结果:pH=5.5环境中，liaS和liaR基因敲除株的生长受到显著抑制（ P<0.05）。适应性耐酸曲线显示敲除株与野生株相比，固有耐酸和适应性耐酸能力均显著下降（ P<0.05）。对三菌株无预酸化处理20和40 min以及预酸化处理20和40 min后，liaS基因敲除株生存率［（8.98±2.00）%、（0.18±0.07）%、（14.88±8.64）%、（0.82±0.91）%］和liaR基因敲除株生存率［（0.38±0.19）%、（0.34±0.18）%、（7.89±2.02）%、（1.52±0.37）%］均分别显著低于野生株［（32.49±9.75）%、（1.27±0.32）%、（62.76±29.06）%、（8.02±1.25）%］（均 P<0.05）。此外，liaS和liaR敲除株膜流动性（0.18±0.04和0.18±0.05）均显著低于野生株（0.08±0.05）（均 P<0.01）；不饱和脂肪酸合成基因fabM表达水平（0.52±0.11和0.57±0.05）与野生株（1.04±0.30）相比均显著降低约1/2（均 P<0.001）；H +-ATP酶活性（917.06±59.53和469.53±47.65）与野生株（127.00±50.71）相比显著升高7.22和3.70倍（均 P<0.001），且编码H +-ATP酶基因atpD的表达水平（3.39±0.21和1.94±0.17）也较野生株（1.00±0.15）显著升高3.39和1.94倍（均 P<0.01）。liaR基因敲除株的终末pH值（4.76±0.01）显著低于野生株（4.90±0.00），liaS基因敲除株的终末pH值（5.19±0.01）显著高于野生株（均 P<0.001）。liaS和liaR基因敲除株与野生株相比，Sm 593生物膜总量未发生明显变化，生物膜活菌数均显著少于野生株（均 P<0.05），且eDNA含量均显著高于野生株（均 P<0.01）。liaS基因敲除株生物膜水溶性多糖含量与野生株相比显著增加1.88倍（ P=0.003）。liaS和liaR基因敲除株胞外多糖合成相关基因gtfD表达水平较野生株显著升高47.43和16.90倍（均 P<0.05），liaS基因敲除株中gtfC基因比野生株显著高表达1.65倍（ P=0.014）。 结论:LiaSR双组分信号转导系统通过调控膜不饱和脂肪酸合成和胞膜流动性，参与Sm 593的耐酸过程；LiaR反应调节蛋白还可参与调节膜质子通透性，增强Sm 593的耐酸能力；此双组分信号转导系统可负向调控生物膜胞外基质的产生。

目的:探讨甘氨酸对经烧伤大鼠血清（以下简称烧伤血清）干预的大鼠心肌细胞的作用及其机制。方法:采用实验研究方法。取30只7~8周龄雌雄各半Wistar大鼠，其中10只用于制备正常大鼠血清（以下简称正常血清），将另20只造成30%体表总面积Ⅲ度烧伤后制备烧伤血清；从180只1~3 d龄雌雄不拘Wistar大鼠心尖组织中分离培养原代心肌细胞用于后续实验。按随机数字表法（分组方法下同）将细胞分为用相应血清处理的正常血清组、烧伤血清组，于处理1、3、6、9、12 h进行锥虫蓝染色检测细胞存活率；将细胞分为用烧伤血清处理6 h后常规培养30 min的单纯烧伤血清组和用烧伤血清处理6 h后加相应终物质的量浓度甘氨酸培养30 min的0.4 mmol/L甘氨酸组、0.8 mmol/L甘氨酸组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组、2.0 mmol/L甘氨酸组，即干预6.5 h，同前检测细胞存活率。将细胞分为正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L甘氨酸组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组，分别同前干预6.5 h，采用高效液相色谱法检测腺苷一磷酸（AMP）和ATP含量并计算AMP/ATP比值，采用蛋白质印迹法检测磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（p-mTORC1）、磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶（p-p70 S6K）、磷酸化真核翻译起始因子4E结合蛋白1（p-4E-BP1）、磷酸化AMP活化蛋白激酶（p-AMPK）蛋白表达。将细胞分为同前干预的正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L甘氨酸组和用烧伤血清处理后加2种试剂培养的0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组，于处理1、3、6 h行相应培养30 min，即干预1.5、3.5、6.5 h，采用免疫荧光法检测热休克蛋白70（HSP70）、金属硫蛋白（MT）和微管蛋白表达并观察干预6.5 h微管形态。各时间点样本数均为10。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验、LSD检验及Bonferroni校正。 结果:处理1、3、6、9、12 h，烧伤血清组细胞存活率均明显低于正常血清组（ t值分别为4.96、16.83、35.51、34.33、27.88， P<0.05）。在烧伤血清组中，处理3、6、9、12 h细胞存活率均较处理1 h明显降低（ P<0.05），处理6、9、12 h细胞存活率均较处理3 h明显降低（ P<0.05），处理6 h细胞存活率与处理9 h相近（ P>0.05）但明显高于处理12 h（ P<0.05）；选择处理6 h作为后续烧伤血清干预时间。干预6.5 h，与单纯烧伤血清组比较，各甘氨酸组细胞存活率均明显升高（ P<0.05）。0.8 mmol/L甘氨酸组细胞存活率最高，选择0.8、1.2、1.6 mmol/L作为后续甘氨酸的干预浓度。干预6.5 h，单纯烧伤血清组细胞AMP/ATP比值较正常血清组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组明显升高（ P值均<0.05），1.6 mmol/L甘氨酸组细胞AMP/ATP比值较0.8 mmol/L甘氨酸组明显降低（ P<0.05）。干预6.5 h，正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L 甘氨酸组、1.2 mmol/L 甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-p70 S6K、p-4E-BP1蛋白表达水平分别为1.001±0.037、0.368±0.020、1.153±0.019、1.128±0.062、1.028±0.037，0.96±0.07、0.63±0.12、1.17±0.13、1.13±0.16、1.11±0.11，0.98±0.06、0.45±0.08、1.13±0.05、0.77±0.12、0.51±0.13。与单纯烧伤血清组比较，正常血清组与各甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-p70 S6K和p-4E-BP1蛋白表达均明显升高（ P<0.05），p-AMPK蛋白表达均明显降低（ P<0.05）；与0.8 mmol/L甘氨酸组比较，1.2 mmol/L甘氨酸组细胞p-4E-BP1蛋白表达以及1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1与p-4E-BP1蛋白表达均明显降低（ P<0.05）；与1.2 mmol/L甘氨酸组比较，1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-4E-BP1蛋白表达均明显降低（ P<0.05），p-AMPK蛋白表达明显升高（ P<0.05）。与正常血清组比较，单纯烧伤血清组细胞干预1.5、3.5、6.5 h微管蛋白表达均明显降低（ P<0.05），干预1.5、3.5 h HSP70表达和干预3.5、6.5 h MT表达均明显升高（ P<0.05）；单纯烧伤血清组与0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组细胞干预1.5、3.5、6.5 h HSP70、MT表达以及干预1.5、3.5 h微管蛋白表达均明显低于0.8 mmol/L甘氨酸组（ P<0.05）。干预6.5 h，与正常血清组比较，单纯烧伤血清组细胞微管结构紊乱；0.8 mmol/L甘氨酸组细胞边界较单纯烧伤血清组清晰，微管结构近核部位排列整齐；与0.8 mmol/L甘氨酸组比较，0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组细胞边界不清，微管结构紊乱。 结论:烧伤血清可导致大鼠心肌细胞受损，甘氨酸可通过AMP活化蛋白激酶显著上调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/p70核糖体蛋白S6激酶/真核翻译起始因子4E结合蛋白1信号通路，促进心肌细胞保护性蛋白HSP70、MT和微管蛋白合成，稳定微管结构，实现心肌细胞保护作用。

以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)等为原料,来源于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的ATP硫酸化酶(ATPS)和来源于产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)的APS激酶(APSK)构建的多酶催化体系可合成3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS).同时,在酶法合成PAPS的反应体系中引入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的无机焦磷酸水解酶(PPase),消耗反应过程中的副产物PPi,使得反应向生成PAPS的方向进行,大幅提高多酶法合成PAPS的产率.本研究构建了重组质粒pET-28a-sumo-ATPS、pET-28a-APSK和pET-28a-PPase,并在大肠杆菌中表达了重组酶,研究酶学性质和优化多酶催化反应合成PAPS的反应条件,以提高PAPS的产量水平,最终PAPS的累积量为14.47 g/L.该工艺可大幅降低PAPS的制备成本.

背景 心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)严重威胁着心血管疾病患者生命安全,合并糖尿病患者病死率明显增加.缺血后处理(ischemic postconditioning,IPO)作为一种有效的心肌保护途径,其保护机制最终作用于线粒体,但其线粒体机制有待深入研究. 目的 总结IPO心肌保护作用中线粒体机制的研究进展. 内容 IPO心肌保护机制通过诱导内源性触发因子(如内源性腺苷的释放),激活再灌注损伤补救激酶(reperfusion injury salvage kinase,RISK)和生存活化因子增强(survival activation factor enhancement,SAFE)等内源性信号转导途径,然后激活信号转导及转录激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3,STAT3)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC),促进糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)磷酸化,开放线粒体敏感性钾离子通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel,mitoKATP通道)和关闭线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP),通过增加线粒体心磷脂、缝隙连接蛋白43 (connexin 43,Cx43)及抗凋亡基因Bcl-2的表达,使线粒体型硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)2及线粒体呼吸链的结构及功能完整,从而减轻MI/RI. 趋向 IPO心肌保护作用,包括合并糖尿病患者,其机制与线粒体密切相关,但其具体机制尚需进一步研究,以期找到减轻MI/RI、尤其合并糖尿病MI/RI的新靶点,以造福广大心血管患者.

探讨硫化氢对线粒体损伤后氧化呼吸链的影响.已有研究证实,硫化氢在线粒体损伤后有保护氧化呼吸链,稳定细胞色素C氧化酶活性及氧化磷酸化反应的作用,进而保证ATP的生成.通过对比国内相关研究,就硫化氢对线粒体损伤后氧化呼吸链的影响,归纳其作用机制,为今后硫化氢的进一步研究提供相关的理论基础.

目的 探讨哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)中肌浆/内质网Ca2+-ATP酶(SERCA2)的表达对IL-8分泌的影响.方法 建立卵清蛋白(OVA)诱导的哮喘大鼠模型,分离原代ASMCs,分别用qRT-PCR及Western blotting、Fura PE-3/AM和ELISA法检测各组ASMCs中SERCA2表达、细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)和IL-8,利用siRNA技术下调SERCA2、毒胡萝卜素(TSG)抑制SERCA2以及吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)抑制NF-kB活化,检测不同状态下IL-8的变化.结果 与正常组比较,哮喘组SERCA2的表达减少,经缓激肽(BK)刺激的钙瞬变峰值明显下降,需更长时间重新摄取钙使[Ca2+]i恢复至基线水平,IL-8基础值和经IL-17刺激后的诱导值均增加(P<0.05或0.01).无论有无IL-17刺激,基因下调组IL-8 mRNA表达和分泌均显著增加(均P<0.01),与哮喘对照组比较差异均无统计学意义(均P>0.05).哮喘组IkBα磷酸化和NF-kB p65核转位均较正常组增加(P<0.05或0.01),基因下调组和TSG抑制组的NF-kB p65核转位亦增加(P<0.05或0.01),而使用PDTC后,基因下调组、哮喘对照组和正常对照组在IL-17刺激诱导下的IL-8 mRNA表达和分泌均减少(P<0.05或0.01).结论 哮喘大鼠ASMCs中SERCA2表达减少,导致钙稳态的改变,可能通过增强NF-kB活化来介导IL-8分泌亢进.

解析镉(Cd)胁迫下外源乙烯和硫(S)对马齿苋(Portulaca oleracea L.)生理响应的机制.在Cd胁迫下,检测乙烯利(乙烯供体)和(NH4)2SO4对马齿苋叶片氧化胁迫、S同化吸收、葡萄糖含量、乙烯合成、光合作用的影响.结果显示,外源S和乙烯处理,可降低Cd胁迫下马齿苋叶片与根中的Cd含量;增强ATP硫酸化酶(ATP-S)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性,提升马齿苋叶片还原型谷胱甘肽(GSH)含量,从而降低叶片H2O2与丙二醛(MDA)含量;增强1-氨基环丙烷羧酸合酶(ACS)活性,提升叶片乙烯含量,从而降低葡萄糖含量,提升Rubisco酶活性和光合作用.同时添加外源S和乙烯,对上述指标的促进或者抑制效果加强,而添加乙烯活性专一性抑制剂二环庚二烯(Norbornadiene,NBD)则对上述各指标具有反向作用.外源S和乙烯可以通过降低马齿苋对Cd的吸收,增强体内乙烯信号传导途径,促进GSH的合成,降低葡萄糖含量,从而缓解Cd胁迫诱导的氧化胁迫和葡萄糖介导的光合抑制作用.

以砧木分别为平邑甜茶(Malus hupehensis var.pingyiensis)和八棱海棠(Malus×robusta)的两年生盆栽'红富士'苹果(Malus domestica'Red Fuji')为试材,设置土壤中度和重度紧实,分析根系硫化氢(H2S)生成及ATP硫酸化酶(ATPS)、O-乙酰丝氨酸裂解酶(OASTL)和L-/D-半胱氨酸脱巯基酶(L-/D-CD)等硫代谢相关酶的变化.结果 表明:不论以平邑甜茶还是八棱海棠为砧木,苹果幼树根系H2S含量均在中度和重度紧实胁迫下显著下降,而ATPS、OASTL和L-/D-CD活性在重度紧实胁迫下显著下降,上述指标均以平邑甜茶为砧木时下降幅度更大.此外,各种紧实度土壤中,以八棱海棠为砧木的苹果幼树根系H2S含量以及ATPS、OASTL和L-/D-CD活性均高于以平邑甜茶为砧木的幼树.这些表明苹果根系硫代谢对土壤紧实度反应敏感,重度紧实显著降低根系硫代谢水平,并且以平邑甜茶为砧木的比以八棱海棠为砧木的苹果根系更易受到土壤紧实度变化的影响.

目的 探索丹参多酚酸盐(SAL)对过氧化氢(H2O2)所致H9c2心肌细胞线粒体的保护作用及其机制.?方法 以100μmol/L的H2O2干预对数生长期H9c2细胞4 h建立心肌细胞氧化损伤模型,设H2O2组、SAL(50、100、200 mg/L)组;另取对数生长期H9c2细胞设为正常组.药物干预24 h后,通过激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体形态,通过透射电子显微镜观察线粒体超微结构;Jc-1荧光探针法检测膜电位(△ψm),检测膜通透性转换孔(MPTP)开放度;DCFH-DA探针法检测细胞活性氧(ROS)含量,Western blot法检测线粒体动力相关蛋白1(Drp1)、磷酸化Drp1(p-Drp1)、细胞色素C(Cyt C)蛋白;比色法检测Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性及三磷酸腺苷(ATP)含量;原子化学发光法检测钙离子(Ca2+)浓度;硫代巴比妥酸法检测线粒体丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化法、钼酸铵法分别检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性. 结果(1)五组细胞线粒体平均面积比较,差异有统计学意义(F=52.076,P<0.05).与H2O2组比较,SAL 100、200μg/mL组H9c2细胞线粒体分裂明显减少,线粒体平均面积升高(P<0.05),与SAL 50μg/mL组比较,SAL 100μg/mL组线粒体平均面积显著增加(P<0.05),与SAL 100μg/mL组比较,SAL200 mg/L组线粒体平均面积显著增加(P<0.05).(2)与H2O2组比较,SAL 100、200μg/mL组线粒体超微结构病变明显改善.(3)与H2O2组比较,SAL 100、200 mg/L组H9c2细胞ROS含量显著降低(P<0.05);与SAL 100 mg/L组比较,SAL 200 mg/L组ROS含量显著降低(P<0.05).(4)与H2O2组比较,SAL 100、200 mg/L组H9c2细胞线粒体△ψm显著升高且MPTP开放度显著降低(P<0.05);与SAL 50 mg/L组和SAL 100 mg/L组比较,SAL 200 mg/L组△ψm显著升高且MPTP开放度显著降低(P<0.05).(5)与H2O2组比较,SAL 100、200 mg/L组H9c2细胞Drp1、p-Drp1、Cyt C表达明显下调(P<0.05),且p-Drp1/Drp1显著降低(P<0.05);与SAL 100 mg/L组比较,SAL 200 mg/L组p-Drp1、Cyt C表达明显下调(P<0.05).(6)与H2O2组比较,SAL 100、200 mg/L组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性和ATP含量显著升高且Ca2+浓度显著降低(P<0.05);与SAL 50 mg/L组比较,SAL 100 mg/L组Ca2+-Mg2+-ATP酶活性和ATP含量显著升高(P<0.05),SAL 200 mg/L组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性和ATP含量显著升高且Ca2+浓度显著降低(P<0.05);与SAL 100 mg/L组比较,SAL 200 mg/L组ATP含量显著升高且Ca2+浓度显著降低(P<0.05).(7)与H2O2组比较,SAL 100、200 mg/L组MDA含量显著降低而SOD、CAT活性显著升高(P<0.05);与SAL 50 mg/L组比较,SAL 200 mg/L组MDA含量显著降低而SOD、CAT活性显著升高(P<0.05);与SAL 100 mg/L组比较,SAL 200 mg/L组MDA含量显著降低而CAT活性显著升高(P<0.05).?结论 SAL对H2O2所致H9c2心肌细胞线粒体结构和功能损伤具有保护作用,其机制可能与提高抗氧化酶活性、抑制Drp1磷酸化和抑制Ca2+超载有关.

目的 利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法(UPLC-MS/MS)测定附子水煎液中生物碱成分,并运用网络药理学探究其抗肿瘤的多成分、多靶点、多途径作用机制,为附子抗肿瘤的物质基础研究提供参考.方法 使用UPLC-MS/MS技术定量分析附子水煎液中12种生物碱含量.借助Swiss Target Prediction、Gene Cards平台预测附子生物碱成分与肿瘤的疾病靶点,用Cytoscape软件构建相关作用网络,并对核心基因进行GO分析与KEGG通路富集.结果 附子水煎液中单酯型生物碱含量最高,约占59.07％,醇胺型生物碱含量次之,约为29.48％.网络药理学推测附子生物碱抗肿瘤关键靶点为甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)、ATP结合盒B亚家族成员1(ABCB1)基因,并与炎症反应、磷脂酰肌醇、缺氧诱导因子、雌激素、中心碳代谢等紧密相关.结论 该方法能同时定量分析附子中12种生物碱成分,简便可行、准确可靠,同时网络药理学结果可为附子临床抗肿瘤应用提供依据,为后期分子生物学研究奠定基础.