目的:初步探讨hit基因对变异链球菌生长和致龋力的影响.方法:通过同源重组构建变异链球菌hit基因缺陷株(Δhit)、hit基因回补株(ΔhitC、ΔhitC-eGFP);观察不同pH下Smu.Δhit、Smu.ΔhitC和ATCC25175模式菌株生长曲线;通过结晶紫染色、蒽酮染色、扫描电镜等实验,比较生长、生物膜形成、粘附、菌体形态差异及耐酸特性;通过人工龋实验,在体外模拟菌株对牙釉产生龋样损坏的差异.结果:成功构建Smu.Δhit、Sum.ΔhitC和Smu.ΔhitC-eGFP菌株;观察发现Smu.Δhit较ATCC25175菌株生长迅速,随着pH值降低,Smu.Δhit生长受到部分抑制,ATCC25175则完全被抑制;Smu.Δhit菌体呈"椭圆球状平铺附着"分散在牙釉面上,胞外生物膜量较少;Smu.Δhit造成的龋样损坏明显强于ATCC25175.结论:hit基因调控变异链球菌生长繁殖,Smu.Δhit缺陷株生长速率显著高于亲本株,更耐受酸性环境,对人牙釉面破坏性更强.

目的 研究茶黄素对口腔致龋菌变形链球菌的抑制作用.方法 采用高效液相色谱法检测茶黄素纯度,液体二倍稀释法配制茶黄素药液,变形链球菌ATCC25175制成菌悬液.设置实验组(100 μL不同浓度茶黄素药液+100 μL菌悬液)、生长对照组(200 μL菌悬液)和无菌对照组(200μL不同浓度茶黄素药液),测定最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC).选取1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC茶黄素药液分别与菌悬液混合测定培养前后pH值,分析茶黄素对变形链球菌产酸的影响;扫描电镜观察茶黄素处理后变形链球菌形态变化.结果 茶黄素纯度为68.02％,对变形链球菌的MIC和MBC分别为500 μg/mL和1 000 μg/mL.对照组(只有菌悬液)、1/8 MIC组、1/4 MIC组和1/2 MIC组的△pH值分别为2.18±0.11、2.10±0.05、1.74±0.11和1.01±0.26,差异有统计学意义(P＜0.05).随着茶黄素浓度升高,变形链球菌的产酸能力逐渐下降,1/4 MIC和1/2 MIC组的△pH值较对照组降低(P＜0.05).茶黄素处理后的变形链球菌形态由球形变为杆状,生长较为稀疏.结论 茶黄素能抑制变形链球菌的生长和产酸,具有良好的抑菌作用.

目的 构建hit基因缺陷型变异链球菌株并验证其细胞周期调控的功能.方法 从变异链球菌株ATCC25175中提取基因组DNA,采用PCR扩增技术,将hit基因上下游片段克隆到pFW5质粒(壮观霉素抗性)上以构建重组质粒;利用该菌株天然遗传转化机制,将线性化重组质粒转入由其感受刺激多肽(competence stimulating peptide,CSP)刺激产生变异链球菌感受态中,进行同源重组;再通过壮观霉素抗性筛选,结合PCR产物电泳和Sanger法测序,筛选鉴定hit基因缺陷型变异链球菌株;最后在BHI培养基中培养,检测其生长速率.结果 从ATCC25175变异链球菌基因组DNA中,克隆hit基因上游约856 bp、下游约519 bp片段到pFW5质粒的两个多克隆位点区间(MCS-I和MCS-II),经双酶切和PCR测序鉴定,得到重组质粒pFW5_hit_Up_Down.线性化该重组质粒,转入由CSP刺激产生变链感受态中进行同源重组;再通过壮观霉素BHI培养基多次抗性筛选,hit基因片段的PCR产物电泳和Sanger测序筛选出hit基因缺陷变异链球菌株,该缺陷菌株较其亲本菌株生长更快速(P<0.001).结论 获得具有遗传性状hit基因缺陷变异链球菌株,hit基因产物调控变异链球菌生长周期.

目的:探讨杨梅黄酮对变形链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)ATCC 25175毒力因子和生物膜的作用.方法:用液体稀释法准确测定杨梅黄酮对变形链球菌的最小抑菌浓度(MIC)和耐酸性;用结晶紫染色法检测药物对变形链球菌生物膜形成的抑制率;用乳酸试剂盒检测药物对变形链球菌产酸的影响;用蒽酮法检测药物对不溶性多糖生成量的影响;利用场发射扫描电子显微镜(FESEM)和激光共聚焦显微镜(CLSM)观察及分析药物对生物膜的抑制作用.结果:杨梅黄酮对变形链球菌的最小抑菌浓度为0.8 mg/mL,0.2～0.4 mg/mL的药物对生物膜的生成抑制作用明显,同时乳酸、不溶性多糖的生成量明显降低,0.4 mg/mL的药物对细菌耐酸性以及成熟生物膜的影响有显著性差异.结论:杨梅黄酮对于变形链球菌毒力因子和生物膜有显著的抑制作用.

目的 分离、纯化和鉴定临床变异链球菌株,并构建该临床菌株的412c基因缺陷菌株,比较两者生长速率和致龋性.方法 随机收集无龋健康成人口腔牙菌斑样本,在唾液/变异链球菌杆菌肽琼脂(MSA)培养基中进行厌氧培养和筛选,通过菌斑形态观察、革兰氏染色、细菌生化反应和聚合酶链式反应(PCR)等方法对获得的临床分离株进行鉴定;将线性化重组质粒转入临床变异链球菌中进行同源重组,获得412c(hit)基因缺陷菌株;在不同pH值脑心浸液(BHI)培养基中,比较两者的生长速率和耐酸特性;在含3％蔗糖的BHI培养基中,比较两者的产酸能力.结果 无龋健康成人口腔牙釉质表面菌斑在MSA培养基中生长的菌落形态均为深蓝色半球颗粒状突起、表面粗糙、边缘不齐;革兰氏染色后,显微镜油镜下可见革兰阳性蓝紫色球状菌体,呈长链状和短链状分散;生化反应和412c基因片段PCR Sanger测序鉴定结果显示,临床变异链球菌为"等效变异链球菌UA159"菌株.将hit-UP-pFW5-Down重组质粒线性化后转入临床变异链球菌中进行同源重组并筛选出412c基因缺陷变异链球菌株,该缺陷菌株生长速率相较其亲本菌株异常快速(与模式菌株ATCC 25175的缺陷菌株相似),其产酸能力略弱于亲本菌株,耐酸性则显著强于亲本菌株.结论 临床分离变异链球菌株为"等效变异链球菌UA159"菌株,其412c基因与细菌生长调控相关,而412c基因缺陷变异链球菌株的生长速率显著高于其亲本菌株,更具致龋潜力.