目的 基于网络药理学和实验研究探讨青光安Ⅱ号方对青光眼视神经的保护作用机制.方法 通过TCMSP数据库筛选青光安Ⅱ号方成分靶点,在GeneCards、Disgenet、CTD数据库挖掘青光眼相关靶点,进而筛选青光安Ⅱ号方作用于青光眼的靶点;制作蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络取其交集,并通过GO分析和KEGG富集分析.建立自发性慢性高眼压DBA/2J青光眼小鼠模型,将C57BL/6J小鼠设置为空白组(等体积蒸馏水),DBA/2J小鼠随机分为模型组(等体积蒸馏水)、益脉康组[0.31 g/(kg·d)]、青光安Ⅱ号方低浓度组[0.85 g/(kg·d)]、青光安Ⅱ号方中浓度组[1.7 g/(kg·d)]、青光安Ⅱ号方高浓度组[3.4 g/(kg·d)],每组 8只,每日灌胃 1 次.干预 4周后,触式眼压笔监测小鼠眼压;HE染色观察小鼠视网膜形态结构;Western blot检测沉默信息调节因子-1(silent information regulator type-1,SIRT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(peroxisome proliferation-activated receptor-γ-coactivator 1α,PGC-1α)的蛋白表达水平;qRT-PCR检测SIRT1、PGC-1α的mRNA表达水平.结果 从青光安Ⅱ号方共筛选得到 101 个活性成分和 245 个相关靶点,2 412个青光眼疾病相关基因靶点;药物-活性成分-靶点相互作用最强的 5个靶点分别是前列腺素内过氧化物合成酶 2、核受体共激活因子 2、胃蛋白酶原Ⅱ、前列腺素内过氧化物合成酶 1 以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG);PPI网络显示较强的靶点是SIRT1、PPARG;GO分析和KEGG富集分析得到细胞衰老、IL-17 等信号通路.与给药前相比,给药后用药组眼压显著降低(P<0.01).给药后,与空白组相比,模型组眼压显著升高(P<0.01),视网膜中SIRT1、PGC-1α mRNA表达量和蛋白表达量均显著降低(P<0.01);与模型组相比,用药组眼压显著降低(P<0.01),SIRT1、PGC-1α mRNA表达量和蛋白表达量均显著升高(P<0.01).与益脉康组和青光安Ⅱ号方低浓度组相比,青光安Ⅱ号方中、高浓度组SIRT1、PGC-1α mRNA表达量和SIRT1蛋白表达量显著升高(P<0.01);与青光安Ⅱ号方低浓度组相比,青光安Ⅱ号方高浓度组PGC-1α蛋白表达量均显著上升(P<0.01).与青光安Ⅱ号方中浓度组相比,青光安Ⅱ号方高浓度组PGC-1α mRNA表达量和蛋白表达量显著升高(P<0.01).结论 青光安Ⅱ号方可有效调控SIRT1/PGC-1α信号通路,抑制RGC的丢失,主要在氧化应激、细胞衰老等方面对青光眼视神经发挥保护作用.

目的:了解重庆市2014年至2018年接受高效抗反转录病毒治疗的人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)感染者耐药突变情况。方法:收集2014年5月至2018年12月在重庆市公共卫生医疗救治中心进行高效抗反转录病毒治疗6个月以上的HIV-1感染者880例，采集其血浆标本，使用一步法反转录聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和巢式PCR扩增HIV-1 pol基因区的蛋白酶及反转录酶区，获得的扩增序列与耐药数据库对比进行HIV-1基因型耐药分析。采用病毒基因分型工具软件分析HIV-1亚型分布。计数资料比较采用 χ2检验。 结果:880例患者中，血浆HIV-1病毒载量为(4.12±0.63) lg拷贝/mL；CD4 ＋T淋巴细胞计数为(251±124)/μL；抗病毒治疗中位时间为26个月。亚型分析中，重组型( circulating recombinant form, CRF)01-AE亚型在HIV-1亚型中占比最大，为38.9%(342/880)，CRF07-BC亚型占28.5%(251/880)，B＋C亚型占16.2%(143/880)。其中534例患者存在耐药突变，总耐药率为60.7%。对核苷类反转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitor, NRTI)、非核苷类反转录酶抑制剂(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor, NNRTI)和蛋白酶抑制剂(protease inhibitor, PI)的耐药率分别为51.0%(449/880)、58.6%(516/880)和1.7%(15/880)。对拉米夫定、恩曲他滨、依非韦仑和奈韦拉平的耐药较为严重，中高度耐药率分别为46.8%(412/880)、46.8%(412/880)、51.3%(451/880)和53.6%(472/880)；而对齐多夫定(6.0%，53/880)、依曲韦林(9.0%，79/880)和PI类药物的耐药情况尚不严重。NRTI最常见的耐药突变位点为M184IV(47.3%)、K65R(22.2%)和K70RE(12.6%)；NNRTI为K103NS (25.1%)、V106A(19.7%)和V179DE(14.4%)；PI为L10FIV(7.4%)和A71IVT(6.5%)。CRF01-AE亚型的耐药率为69.3%(237/342)高于CRF07-BC亚型的49.8%(125/251)和B＋C型的51.0%(73/143)，差异均有统计学意义( χ2＝22.6、14.6，均 P<0.05)。 结论:重庆市HIV-1感染者经高效抗反转录病毒治疗6个月后，耐药发生率高，以对NNRTI类药物耐药最为多见，其次为NRTI，PI较少耐药。耐药是HIV-1感染者病毒学突破的主要原因。

患儿男，3岁6个月，生后即发现多发带状分布的白色斑疹，随身体等比例生长，无自觉症状，伴右手拇指畸形及右手活动障碍。患儿平素不喜与人交流，注意力较同龄儿童差。否认家族史。体检：神志清，精神可，语言表达欠佳；特殊面容，右手拇指关节较左侧略膨大；心、肺、腹未见异常。皮肤科检查：右胸部、右上肢屈侧、下腹正中线及右下肢可见大小不等的多发片状、带状不规则白色斑疹，部分斑疹融合，大致沿Blaschko线分布，局部略隆起；右手掌、拇指桡侧可见条带状褐色斑。下肢白斑皮损组织病理检查示基底样毛囊错构瘤。头颅磁共振成像提示胼胝体发育不全。患儿病变组织全外显子测序显示SMO基因突变c.1234C>T（p.L412F），父母均无该位点突变。根据皮损表现、病理及基因检测结果，该患儿诊断为Curry-Jones综合征，SMO基因突变c.1234C>T（p.L412F）可能是其致病原因。予患儿右手拇指功能锻炼并密切随访。

目的:探讨 GAMT基因变异所致的肌酸缺乏综合征(creatine deficiency syndromes, CDS)患儿的临床表现及遗传学的特点。 方法:应用全外显组测序技术(whole exome sequencing, WES)对患儿进行全外显子水平变异分析，Sanger测序法对可能的变异位点进行验证；磁共振波普(magnetic resonance spectrum，MRS)检测大脑中的肌酸水平，并复习文献总结该类疾病的特点。结果:患儿临床表现为发育落后，智力低下，叫之反应差，双眼可追物。四肢肌力及肌张力均未见明显异常，动作不灵活。脑电图提示界限性儿童脑电图；MRI提示脑白质发育异常、胼胝体发育异常；尿有机酸筛查结果提示甘油三磷酸增高。高通量测序发现该患儿 GAMT基因存在复合杂合变异，其中c.412C>T(p.Pro138Ser)杂合变异遗传自母亲；剪接位点变异IVS4-1G>A遗传自父亲。头颅MRS示双侧基底节区肌酸降低，提示脑肌酸缺乏。剪接位点功能验证显示变异导致 GAMT基因第5外显子缺失。 结论:本研究发现 GAMT基因两个未见报道的变异，丰富了该基因的变异谱。

孕妇24岁，孕3产2，孕25周。按照《超声产前筛查指南2021》对胎儿进行筛查，胎儿头面部超声检查显示：胎儿颅骨环、大脑镰、透明隔腔、侧脑室、脉络丛、丘脑、小脑、小脑延髓池及上唇冠状切面均未见明显异常；胎儿双侧眼眶可见，双眼球大小正常，双侧晶状体呈高回声，左侧大小约2.9 mm×2.7 mm，右侧大小约3.0 mm×2.9 mm，透声差(图1)。胎儿心脏超声检查显示：四腔心结构存在，心房正位，心室右襻，左右心房、心室腔基本对称，左心室流出道、右心室流出道可显示，左心室可见一点状强回声(图2)。胎儿脊柱、胸腔、腹部、四肢等结构均未见明显异常。产前超声提示：胎儿双侧晶状体呈高回声，先天性白内障可能，胎儿左心室点状强回声，建议遗传咨询。胎儿12 ＋4周超声检查提示颈项透明层1.0 mm，15 ＋1周胎儿无创DNA检测21-三体、18-三体、13-三体均为低风险，耳聋基因检测未见异常。家族史：夫妻双方均健康，否认家族性传染病史、遗传病史及类似疾病史。孕产史：孕妇怀孕3次，第一胎，女性，产检未见异常，产后体检正常，第3个月时出现呼吸功能异常，抢救无效死亡，未进一步明确诊断；第二胎，女性，产检未见异常，生后左眼瞳孔中心可见白点，右眼不明显白点，2个月时确诊先天性白内障，3个月左右夭折，未进一步明确诊断；本次为第三次妊娠，产前超声提示胎儿双侧晶状体呈高回声，先天性白内障可能，胎儿左心室点状强回声，建议遗传咨询。孕妇及家属慎重考虑后决定终止妊娠，于本院引产一女性胎儿，生后双眼瞳孔可见白点，孕妇拒绝病理检测，同意基因检测。后全外显子组测序显示：胎儿的AGK基因7号外显子存在1个纯合变异c.412C>T(p.R138*)(图3)，为无义突变，经Sanger验证，该变异遗传自父母。

目的:探讨核基因变异致新生儿原发性线粒体疾病患儿的临床表现和基因变异特点。方法:收集2020年5月至2022年3月新乡医学院第一附属医院新生儿科和中南大学湘雅二医院新生儿专科收治的核基因变异致新生儿原发性线粒体疾病患儿的临床资料、基因检测结果及随访信息进行回顾性分析。结果:共纳入4例患儿，均有高乳酸血症和代谢性酸中毒；病例1母孕期胎儿头颅磁共振成像示胼胝体缺如，病例2生后心脏彩超提示肥厚性心肌病。全外显子检测示4例患儿分别携带EARS2核基因c.1294C>T变异及c.971G>T变异，COA6核基因c.411_412insAAAG变异，ACAD9核基因c.1278+1G>A变异及c.895A>T变异，FOXRED1核基因c.1054C>T变异及c.3dup变异。线粒体二代测序及多重连接探针扩增未发现异常。病例1和病例3于新生儿期死亡，病例2于2岁2个月时死亡，病例4随访至1岁生长发育落后。结论:核基因变异所致新生儿原发性线粒体疾病主要表型为高乳酸血症、顽固性代谢性酸中毒，预后较差，积极基因检测有助于早期诊断。

目的 探讨E-cadherin基因(CDH1)启动子区 3 个遗传性多态位点-160C/A、-347G/GA和 3'UTR+54C/T与上皮性卵巢癌(EOC)患者临床预后之间的关系.方法 运用聚合酶链反应(PCR)方法对 412 例上皮性卵巢癌患者CDH1 基因启动子区-160C/A、-347G/GA和3'UTR+54C/T遗传性多态位点的基因型频率分布情况进行分析.结果 Logistic回归显示,患者的年龄、FIGO分期及残余癌灶的大小与EOC患者 5 年临床预后具有相关性(P<0.05);患者的年龄、FIGO分期与 3 年的临床预后具有相关性,而残余肿瘤的大小仅与患者 3 年复发相关.生存分析提示CDH1-347 G/GA多态性与EOC患者 5 年临床预后相关.与携带G/G基因型的EOC患者比较,携带GA/GA基因型的患者中位PFS和OS时间最短,携带G/GA的患者次之.调整预后因素后(年龄、FIGO分期及肿瘤残余大小),相对于携带G/G基因型的患者,携带GA/GA基因型的EOC患者有较高的疾病复发风险(Hr=2.50;95%CI=1.51～4.13)和死亡风险(Hr=2.50;95%CI=1.51～4.14).结论 CDH1-347 GA/GA位点的多态性与中国北方女性EOC患者预后显著相关.CDH1-347 GA/GA位点多态性有可能成为上皮性卵巢癌患者临床预后的生物学标志物.

目的 探究海马促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)受体1型(CRHR1)在慢性应激致老年前期小鼠学习记忆损伤中的作用机制.方法 12～14月龄的C57BL/6J小鼠根据性别、基因型以及是否予以慢性不可预测应激(CUS)进行分组,对应激组施加为期30 d的CUS.使用聚合酶链式反应(PCR)、琼脂糖凝胶电泳和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对小鼠进行基因型鉴定.新物体识别实验和Morris水迷宫测定学习记忆能力.Golgi-Cox染色观察海马神经元树突受损情况,Western blot测定海马组织雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR(Ser2448)、核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)、p-p70S6K(Thr389/Thr412)蛋白表达,ELISA检测血清CRH水平.结果 相较于慢性应激前,WT应激各组小鼠慢性应激后的认知系数下降,差异有统计学意义(P<0.05),而KN应激各组小鼠慢性应激前后认知系数差异无统计学意义.与WT应激组相比,WT对照组小鼠逃避潜伏期均缩短(P<0.05)、穿越平台和目标象限次数上升(P<0.01),KN各组小鼠上述差异无统计学意义.相较于WT对照组,WT应激组小鼠海马CA1、CA3、DG区神经元复杂性降低(P<0.05),海马p-mTOR、p-p70S6K表达水平均降低(P<0.05);而KN应激组与KN对照组相比,除雌性组小鼠海马p-mTOR表达水平降低外(P<0.05),其余均无显著性差异.此外,与对照组相比,应激各组小鼠血清CRH水平均上升,差异有统计学意义(P<0.01).结论 海马CRHR1调控慢性应激所致的老年前期小鼠的学习记忆损伤和神经元树突受损,其机制可能是慢性应激引起的高水平CRH无法与受体CRHR1结合,减轻了高水平CRH所抑制的mTOR/p70S6K信号通路表达.

目的 探讨shRNA干扰富含亮氨酸重复序列G-蛋白偶联受体5(Lgr5)的表达对结直肠癌肿瘤干细胞(CSCs)恶性行为的影响及其作用机制.方法 采用实验研究方法.流式细胞术分选Lgr5+结直肠癌CSCs,转染shLgr5慢病毒载体设为实验组;转染相应对照病毒,设为对照组.流式细胞术检测Lgr5+细胞比例,荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Lgr5 mRNA的相对表达量;成球实验检测细胞自我更新能力变化;平板克隆形成实验及裸鼠皮下成瘤实验分别检测体内外成瘤能力变化;qRT-PCR检测细胞中干细胞基因(Oct4、Sox2、Nanog、KLF4)、CSCs基因(CD133、CD44、ALDH)及Wnt/β-catenin信号通路关键基因(Axin2、Wnt5a、Wnt3a、Fzd3、c-myc、VEGF、Ascl2、claudin-1) mRNA表达变化.正态分布的计量资料以-x±s表示,组间比较采用t检验.结果 (1) shRNA慢病毒介导转染效率,流式细胞术检测结果显示:实验组Lgr5+细胞为6.8％±1.0％,对照组为92.7％±3.3％,两组比较,差异有统计学意义(t=43.148,P＜0.05).qRT-PCR检测两组CSCs中Lgr5 mRNA相对表达量:实验组和对照组分别为0.168±0.057和1.148±0.004,两组比较,差异有统计学意义(t=28.778,P＜0.05).(2) Lgr5下调对结直肠癌CSCs成球和成瘤能力的影响,成球实验结果显示:实验组和对照组成球数量分别为(29±6)个和(410±10)个,两组比较,差异有统计学意义(t=41.070,P＜0.05).平板克隆成瘤实验结果显示:实验组和对照组克隆成瘤数量分别为(72±4)个和(412±19)个,两组比较,差异有统计学意义(t=31.433,P＜0.05).裸鼠皮下成瘤实验结果显示:实验组和对照组裸鼠肿瘤体积分别为(81±15)mm3和(328±24) mm3,两组比较,差异有统计学意义(t=11.304,P＜0.05).(3) Lgr5下调对相关基因的影响,qRT-PCR检测结果显示:①实验组结直肠癌CSCs中干细胞基因Oct4、Sox2、Nanog、KLF4 mRNA的相对表达量分别为0.377±0.093、0.662±0.104、3.591±0.300、0.425±0.091;对照组结直肠癌CSCs中上述基因mRNA的相对表达量分别为1.957±0.026、2.137±0.015、5.831±0.165、1.536±0.014;两组上述指标比较,差异均有统计学意义(t=23.079,22.261,8.446,19.186,P＜0.05).②实验组结直肠癌CSCs中CSCs基因CD133、CD44、ALDH mRNA相对表达量分别为1.490±0.155、5.535±0.487、1.640±0.039;对照组结直肠癌CSCs中上述基因mRNA的相对表达量分别为2.488±0.061、9.908±0.332、5.718±0.292;两组上述指标比较,差异均有统计学意义(t=8.170,9.667,27.849,P＜0.05).③实验组结直肠癌CSCs中Wnt/β-catenin通路相关基因Axin2、Wnt5a、Wnt3a、Fzd3、c-myc、VEGF、Ascl2、claudin-1 mRNA相对表达量分别为1.592±0.267、0.528±0.138、2.153±0.078、1.480±0.064、0.248±0.128、1.492±0.025、0.658±0.095、1.647±0.087;对照组结直肠癌CSCs中上述基因mRNA的相对表达量分别为3.651±0.224、2.570±0.093、2.301±0.157、1.636±0.058、1.415±0.080、2.610±0.159、2.480±0.123、3.432±0.273;两组结直肠癌CSCs中Axin2、Wnt5a、c-myc、VEGF、Ascl2、claudin-1比较,差异均有统计学意义(t=7.316,15.332,12.649,12.320,14.831,9.063,P＜0.05).两组结直肠癌CSCs中Wnt3a、Fzd3比较,差异均无统计学意义(t=2.887,2.242,P＞0.05).结论 shRNA干扰结直肠癌CSCs中Lgr5表达后,细胞的恶性行为受到抑制,这种作用可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路活性发挥生物学效应.

目的 探讨急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者的基因突变情况及临床特征.方法 应用PCR扩增产物直接测序法检测412例初诊AML患者FLT3-ITD、NPM1、CEBPA、c-KIT、DNM T3A和ND4等基因的突变情况,同时分析其染色体核型,分析不同的基因及染色体突变患者的预后.结果 在412例患者中,FLT3-ITD、NPM1、CEBPA、c-KIT、DNMT3A和ND4基因的突变率分别为9.0％(26/289)、19.1％(50/262)、18.9％(34/180)、3.4％(7/208)、6.6％(9/137)和6.9％(4/58).基因突变预后不良组的患者血小板计数低于预后中等和良好的患者(P=0.001和P=0.001).基因突变预后不良、中等和良好的患者的总生存均未达到中位数,且差异无统计学意义(P>0.05).在完全缓解率方面,基因突变预后各组之间的差异均无统计学意义(P>0.05).基于染色体核型分组,细胞遗传学预后中等的患者白细胞计数分别高于预后良好和预后不良的患者(P<0.001和P=0.004),预后中等的患者血小板计数高于预后良好的患者(P=0.018),而血红蛋白在各组之间的差异无统计学意义(P>0.05).细胞遗传学预后不良患者的总生存与预后良好及中等的患者相比更短,差异有统计学意义(P<0.001和P=0.003),预后良好组的完全缓解率高于细胞遗传学预后中等组(P=0.001).在细胞遗传学预后中等的患者中,基因突变预后不良、中等和良好患者的白细胞及血小板计数、血红蛋白、完全缓解率和总生存的差异均无统计学意义(P>0.05).结论 对于AML患者而言,基因突变与细胞遗传学分析的结果可互为补充,有助于使患者预后的更加精细化和个体化.