人外周血B细胞来源于骨髓，是异质性的。EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)可在体外感染静止B细胞(naive B cells)，利用其潜伏基因表达产物改变B细胞生命周期，从而形成永生化B淋巴母细胞系(B lymphoblastoid cell lines，B-LCLs)，是近年来常用的B细胞永生化的有效方法。B-LCLs常被用作外周血B细胞的替代物和DNA的资源库，通过其单克隆抗体分泌功能、抗原提呈作用和相对稳定的遗传背景等广泛应用于生命科学的各个领域。

目的:构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和荧光素酶(luciferase,Luc)双标记的EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染的人B淋巴母细胞系(B lymphoblastoid cell lines,B-LCL)应用于 肿瘤模型,并比较尾静脉注射和皮下注射人B-LCL细胞建立小鼠模型的优缺点.方法:通过二代慢病毒转染、嘌呤霉素筛选构建GFP/Luc双标的B-LCL细胞系(B lympho-blastoid cell lines double-tagged with GFP and Luc,B-LCL-GL),接种低、中和高 3种剂量的细胞至 NPG[(NOD)/Prkdcscid/IL-2Rγnull]小鼠皮下或尾静脉内,建立皮下移植瘤模型与血行性转移瘤模型并成像分析.结果:B-LCL-GL细胞中的GFP 阳性细胞比例为 92.5%,荧光素酶平均发光强度为 4.80E+08 Photons/s,远高于B-LCL组.在血行性转移瘤模型中,连续成像结果表明从第 7天到第 28天随着肿瘤移植时间的延长,肿瘤最先定植在腹腔后又转移到全身.在皮下移植瘤模型中,第 7天时 3组小鼠均可以检测到肿瘤细胞在小鼠皮下接种处发出了中心强、周围弱的荧光信号,第 28天时高剂量组肿瘤转移到全身.相同接种剂量分别通过尾静脉和皮下接种时,肿瘤生物发光均无显著性差异(P>0.05);小鼠存活情况显示低、中、高各剂量尾静脉注射组在第100天时全部死亡,低剂量和中剂量皮下注射组小鼠带瘤生存长达 100天且未出现小鼠死亡,可允许更长时间进行实验.结论:成功构建GFP/Luc双标的B-LCL细胞系,尾静脉注射和皮下注射异种移植B-LCL细胞两种方法均可成功建立EBV-LCLs肿瘤模型,并可通过成像示踪定位和精准定量肿瘤大小,为肿瘤特性研究及抗肿瘤药物筛选提供了研究平台.

通过脂质体法转染pCMV6-CD40L重组质粒和G418阳性克隆筛选,构建了稳定表达CD40L的NIH3T3细胞系,在RNA和蛋白质水平进行了功能鉴定,对其作为饲养细胞在体外B淋巴母细胞系(B lymphoblastoid cell lines,B-LCLs)培养和在EBV转化B细胞中的作用进行了实验验证.结果表明,NIH3T3-CD40L细胞系不仅可以提高体外低密度B-LCLs存活率,而且可以降低成功建立B-LCLs所需的细胞密度,促进其增殖.该细胞系的成功构建,进一步确证了NIH3T3-CD40L作为饲养细胞可以促进体外低密度B-LCLs的增殖及提高EBV转化B淋巴细胞的效率,优化了体外B细胞培养及EBV转化B淋巴细胞的流程,也为单克隆抗体的制备奠定了基础.

在正常个体中Epstein-Barr（EB）病毒是由病毒特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）所控制，虽不能清除病毒，却对于控制细胞处于潜伏感染状态是必需的。抽取病人血分离淋巴细胞，在实验室制备EB病毒特异性CTL，然后回输到病人体内，具有预防和治疗EB病毒相关疾病的意义。我们将EB病毒潜伏感染膜蛋白（LMP）基因重组到腺病毒伴随病毒载体pACP中去，与包装质粒Ad8共转染已感染了Ⅱ型腺病毒的293细胞，获得重组病毒rAAV-LMP，用此病毒感染淋巴细胞并表达LMP，用高能X线照射灭活，与自体淋巴细胞共培养产生特异性CTL。以EB病毒转化的类淋巴母细胞作靶细胞与CTL反应，用BLT活性法测定CTL活性。结果表明，4株CTL均能够识别和杀伤对应的靶细胞，并且随着CTL数量的增加和反应时间的延长，上清中BLT活性也增强。