目的:探讨联合血管内皮生长因子-C(VEGF-C)的淋巴结组织移植后，对裸小鼠再生淋巴结的免疫微环境的影响。方法:将10只5周龄雌性免疫缺陷裸小鼠按照随机数字表法分为A、B 2组，切除2组裸鼠第一、二乳腺脂肪垫及双腋下蓝染淋巴结、淋巴管及其周围脂肪组织，将切除的每枚淋巴结横切成两半，置于右腋下血管区域。A组于淋巴结碎片周围注射VEGF-C腺病毒40 μl; B组不注射VEGF-C腺病毒，作为对照。淋巴结移植术后2周，于每只裸鼠双侧第2对乳腺脂肪垫中或皮下接种含5×10 6 MDA-MB-231-Luc-GFP肿瘤细胞的悬液100 μl。接种后4周，对右腋下淋巴结进行取材并行HE染色及多光谱免疫荧光检查定性和定量分析，包括淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1(LYVE-1)、M2-巨噬细胞表面特异性抗体F4/80、趋化因子CCL21、程序性死亡配体-1(PD-L1)的表达。使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析，数据采用均值(四分位差)表示，进行Mann Whitney U检验，以 P<0.05为差异有统计学意义。 结果:HE染色结果显示，A组右腋下再生淋巴结可见淋巴滤泡较B组明显增大，生发中心活跃，被膜下淋巴窦、髓质淋巴窦内充满细胞成分，整个淋巴结表现为细胞浸润现象。A组再生淋巴结LYVE-1表达为21.440(34.675)%，较B组的2.964 (4.160)%明显增加，差异有统计学意义( P<0.001)；A组中F4/80表达为5.396 (7.205)%，较B组的3.573 (2.670)%增高，差异有统计学意义( P＝0.020)；A组CCL21表达为21.470 (29.145)%、B组为16.430 (23.600)%，2组差异无统计学意义( P＝0.166)；A组PD-L1表达为10.000 (14.430)%，B组为4.070 (26.740)%, 2组比较差异无统计学意义( P＝0.091)。A组再生淋巴结LYVE-1与CCL21、LYVE-1与F4/80共位置表达分别为8.637 (13.150)%、6.181 (9.050)%，比B组明显增高[1.571 (1.680)%、1.454 (0.830)%]，差异有统计学意义( P<0.001)。 结论:VEGF-C辅助下再生的淋巴结表现为淋巴管内皮细胞过度增生、髓系衍生的抑制细胞明显浸润、趋化因子CCL21及免疫检查点PD-L1表达增加的趋势。再生的淋巴结在肿瘤细胞作用下呈现出一种更加受抑制的免疫状态。

目的:构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和荧光素酶(luciferase,Luc)双标记的EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染的人B淋巴母细胞系(B lymphoblastoid cell lines,B-LCL)应用于 肿瘤模型,并比较尾静脉注射和皮下注射人B-LCL细胞建立小鼠模型的优缺点.方法:通过二代慢病毒转染、嘌呤霉素筛选构建GFP/Luc双标的B-LCL细胞系(B lympho-blastoid cell lines double-tagged with GFP and Luc,B-LCL-GL),接种低、中和高 3种剂量的细胞至 NPG[(NOD)/Prkdcscid/IL-2Rγnull]小鼠皮下或尾静脉内,建立皮下移植瘤模型与血行性转移瘤模型并成像分析.结果:B-LCL-GL细胞中的GFP 阳性细胞比例为 92.5%,荧光素酶平均发光强度为 4.80E+08 Photons/s,远高于B-LCL组.在血行性转移瘤模型中,连续成像结果表明从第 7天到第 28天随着肿瘤移植时间的延长,肿瘤最先定植在腹腔后又转移到全身.在皮下移植瘤模型中,第 7天时 3组小鼠均可以检测到肿瘤细胞在小鼠皮下接种处发出了中心强、周围弱的荧光信号,第 28天时高剂量组肿瘤转移到全身.相同接种剂量分别通过尾静脉和皮下接种时,肿瘤生物发光均无显著性差异(P>0.05);小鼠存活情况显示低、中、高各剂量尾静脉注射组在第100天时全部死亡,低剂量和中剂量皮下注射组小鼠带瘤生存长达 100天且未出现小鼠死亡,可允许更长时间进行实验.结论:成功构建GFP/Luc双标的B-LCL细胞系,尾静脉注射和皮下注射异种移植B-LCL细胞两种方法均可成功建立EBV-LCLs肿瘤模型,并可通过成像示踪定位和精准定量肿瘤大小,为肿瘤特性研究及抗肿瘤药物筛选提供了研究平台.

目的:探讨核转录因子NAC-1 基因沉默对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响.方法:采用LV4-LUC-GFP慢病毒转染建立NAC-1基因沉默SKOV3/DDP细胞株,将细胞接种到免疫缺陷小鼠皮下,建立人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤模型,给予顺铂化疗,比较NAC-1 基因沉默对SKOV3/DDP在裸鼠体内增殖的影响.取肿瘤组织进行转录组测序,利用Illumina平台进行转录组mR-NA测序,筛选差异表达基因,并进行GO和KEGG功能注释和富集分析,揭示NAC-1 基因影响移植瘤化疗敏感的可能分子机制.使用STRING数据库构建DEGs编码蛋白互作网络,筛选MCC算法、Degree 算法、Closeness 算法3 种算法共有基因作为关键基因,使用Metascape网站在线分析这些共同基因的基因功能.结果:与对照组相比,抑制NAC-1 基因后裸鼠皮下肿瘤体积变小,重量减轻,差异有统计学意义(P＜0.05).转录组学分析显示,抑制NAC-1 基因导致肿瘤组织中460 个基因显著下调,568 个基因显著上调.差异基因(DEGs)在多项 GO 富集类别中具有显著差异,如细胞代谢、有丝分裂、坏死、炎症、信号传递等.KEGG 功能富集结果显示,NAC-1 基因沉默可能影响了细胞因子-细胞因子受体相互作用、白细胞跨内皮迁移、神经活性配体-受体相互作用、细胞黏附分子、坏死、ECM受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路等.筛选获得的关键基因主要富集在白细胞介素的信号传导、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)通路、炎症反应等通路.结论:抑制NAC-1 基因能提高人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP化疗敏感性,其可能通过多个信号通路影响肿瘤细胞的代谢、增殖、死亡、炎症反应等.

目的 比较两种转染试剂Lipofectamine LTX&PLUS和罗氏X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染重组质粒至Caco-2细胞的转染效率. 方法 分别采用Lipofectamine LTX & PLUS转染试剂与罗氏X-tremeGENE HP转染试剂转染Caco-2细胞,以荧光素酶(Luc)和绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,利用荧光信号检测仪检测荧光信号,Lipofectamine LTX和质粒的比值分别为4∶1,3. 5∶1,2∶1,罗氏X-HP与质粒的比值分别为3∶1,2∶1,1∶1,对转染试剂和质粒DNA之间的比值进行优化,然后比较两种转染试剂的转染效率;荧光倒置显微镜观察转染效果. 结果 对于Caco-2细胞,两种转染试剂均未影响细胞的正常形态,细胞毒性小.罗氏X-HP转染试剂与DNA质粒的比例是3∶1时转染效率较高(P＜0. 05),LTX转染试剂与DNA质粒的比例为3. 5∶1时转染条件最佳(P＜0. 05).比较两者的转染效率,罗氏转染试剂(Firefly RLU/Renilla RLU＝0. 667)高于LTX转染试剂(Firefly RLU/Renilla RLU＝0. 502)(P＜0. 05). 结论 不同的转染试剂对相同细胞的转染效率不同.相比较而言,罗氏转染试剂对于Caco-2细胞的转染更为合适.

目的 建立绿色荧光蛋白(GFP)/荧光素酶(Luc)双标的人食管癌ECA109细胞系(ECA109-Luc-GFP),采用一种非侵入性的生物活体成像方法监测食管癌裸鼠肿瘤模型.方法 MTT、流式细胞仪、划痕实验分析法检测ECA109-Luc-GFP细胞系与正常ECA109细胞的生物学特性差异.利用活体成像系统示踪肿瘤.结果 与正常ECA109相比,ECA109-Luc-GFP细胞在细胞活力、增殖和迁移能力方面差异均无显著性(P>0.05).利用小动物活体成像实验技术观察了肿瘤生长、转移等生物学特性.结论 成功构建了GFP/Luc双标的人食管癌ECA109细胞系(ECA109-Luc-GFP),应用小动物活体成像应用技术并活体观察食管癌动物模型的生长、转移.

目的 探讨一种新型生物材料明胶微支架装载脂肪间充质干细胞(ADMSC)移植修复犬椎间盘退行性变的治疗效果.方法 选用12只健康成年比格犬,采用穿刺抽吸髓核法建立椎间盘退行性变模型(L3～7),提取自体ADMSC并应用Luc-GFP慢病毒标记.4周后将犬椎间盘节段分为对照组(L7/S1)、模型组(L3/L4)、干细胞组(L4/L5,造模后注射ADMSC)、微支架组(L5/L6,造模后注射明胶微支架)、微支架装载干细胞组(L6/L7,造模后注射ADMSC和微支架共培养物).分别于造模前及造模后4、8、12、24周行腰椎X线及MRI检查,观察椎间盘相对高度(术后椎间盘高度与术前椎间盘高度的比值)及相对灰度(MRI髓核组织灰度值与脑脊液灰度值的比值)的变化.24周后取椎间盘髓核组织,行冰冻切片荧光、HE染色及番红O染色观察,用ELISA法检测软骨相关蛋白SOX-9、PG和COL2的含量.结果 影像学结果显示,造模后各组椎间盘相对高度及相对灰度与对照组相比均明显降低;造模后8、12、24周,微支架装载干细胞组椎间盘相对高度及相对灰度高于模型组、干细胞组和微支架组,差异均有统计学意义(P<0.05).术后24周,微支架装载干细胞组和干细胞组髓核组织冰冻切片内能够检测到Luc-GFP+-ADMSC表达,且微支架装载干细胞组表达比干细胞组多.HE和番红O染色显示微支架装载干细胞组椎间盘退行性变比模型组、干细胞组和微支架组轻,蛋白定量检测结果显示微支架装载干细胞组髓核组织内SOX-9、PG和COL2表达高于模型组、微支架组和干细胞组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 明胶微支架装载ADMSC移植可延缓比格犬椎间盘退行性变,有望为发生退行性变的椎间盘组织的修复治疗提供新的策略.

目的:建立一种可以实时、定量、动态监测的肝细胞癌原位移植模型,并利用活体荧光成像系统对裸鼠体内原位肝细胞癌生长进行分析.方法:利用慢病毒包装系统包装pCDH-GFP-Luc质粒,将绿色荧光蛋白(GFP)和萤光素酶(Luc)基因通过病毒感染的方式整合到HepG2肝癌细胞染色体中,利用流式细胞术分选GFP+细胞,扩增培养后,将该细胞注射到裸鼠皮下进行成瘤,成瘤后分离肿瘤组织接种裸鼠肝脏,将造模成功的裸鼠分为对照组和治疗组,分别灌胃给与0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和50 mg/kg索拉非尼,2/d,连续28 d,每7d利用活体荧光成像系统观察肝癌细胞在对照组和治疗组裸鼠肝脏内的生长情况.实验结束后,分离裸鼠肝脏肿瘤,拍照称重.结果:建立了稳定表达双荧光的人肝癌细胞系HepG2-GFP-Luc,体外发光强度与表达萤光素酶的细胞数量呈正相关(R2=0.9945);建立了肝细胞癌原位移植活体荧光成像模型,对照组和治疗组肝脏内肿瘤细胞荧光强度随时间的延长逐渐增加,治疗组荧光强度明显低于对照组.定量分析结果显示,在第24、31和38 d,治疗组荧光总光子数值显著低于对照组;治疗组平均瘤重显著低于对照组.结论:建立了一种肝细胞癌原位移植荧光成像模型,可通过活体成像系统对肿瘤大小进行动态定量分析,为抗肝癌药物的药效学评价提供了实时定量分析动物模型.

目的 :探讨不同灵长类动物限制因子不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(SAM HD1)的抗病毒、抑制逆转录转座子LINE-1和减弱干扰素(IFN)产生信号通路等作用,为灵长类动物SAM HD1的研究提供依据.方法 :构建稳定表达不同灵长类动物SAM HD1蛋白的U937细胞系,以空载体构建的细胞作为阴性对照组,以稳定表达不同灵长类动物SAM HD1蛋白的U937细胞系为实验组.经佛波酯(PMA)刺激分化成巨噬样细胞后,流式细胞术分析各组HIV-1病毒感染率.以单独转染SAMHD1表达质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染SAM HD1与HIV-2/SIV Vpx表达质粒的细胞为实验组,转染后48 h收获细胞,采用Western blotting法检测SAM HD1蛋白表达水平,免疫荧光检测法观察不同SAM HD1蛋白的细胞内定位.以单独转染LINE-1-GFP报告质粒的HEK293T细胞作为对照组,以共同转染LINE-1-GFP与SAM HD1表达质粒的细胞为实验组,采用流式细胞术检测GFP阳性细胞率,代表SAM HD1对LINE-1转座子的活性.以单独转染IFN-luc报告质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染IFN-luc和SAM HD1表达质粒的细胞为实验组,采用化学发光仪检测HEK293T细胞中荧光素酶的表达水平.结果 :与阴性对照组比较,灵长类动物SAM HD1稳定表达的实验组HIV-1病毒感染率明显降低(P<0.01).与对照组比较,实验组灵长类动物SAMHD1蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01).免疫荧光检测,灵长类动物SAMHD1蛋白均定位于细胞核中.与对照组比较,实验组GFP阳性细胞率明显降低,即SAMHD1对LINE-1转座子活性降低(P<0.05或P<0.01).与对照组比较,实验组灵长类动物HEK293T细胞中荧光素酶表达水平明显降低(P<0.05).结论 :不同灵长类动物SAM HD1蛋白具有抵抗HIV-1病毒感染、抑制逆转录转座子LINE-1以及拮抗天然免疫系统产生IFN的作用.

目的 评价硝呋替莫(nifurtimox)对人源性神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y裸鼠肾转移瘤的治疗作用.方法 采用MTT法测定硝呋替莫对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用;使用由本实验室构建的稳定表达萤火虫荧光素酶(luc2)和绿色荧光蛋白(GFP)的SH-SY5Y细胞,荧光显微镜下观察硝呋替莫对SH-SY5Y(luc2/GFP)细胞的生长抑制;建立荷SH-SY5Y细胞的nu/nu裸鼠肾转移瘤动物模型,使用IVIS Spectrum CT成像系统体外检测活细胞与发光强度的相关性,并监测动物模型体内肿瘤生长状况,主要依据发光强度评价该药体内抗肿瘤效果.结果 MTT结果显示,硝呋替莫可明显抑制SH-SY5Y(luc2/GFP)细胞增殖,IC50值为(25.88± 1.48) ～ (26.74± 1.27) mg/L;荧光显微镜下也同样观测到硝呋替莫显著抑制SH-SY5Y (luc2/GFP)细胞的生长;IVIS Spectrum CT检测体外细胞显示,活细胞数与发光强度呈正相关(R2=0.99749);体内实验表明,该药能显著延缓肾转移瘤SH-SY5Y(luc2/GFP)模型裸鼠的疾病进展、缓解其体质恶化,其对裸鼠生物发光强度抑制率和荷瘤鼠的抑瘤率呈现明显的剂量效应关系,最大抑制率分别为86.4％和71.8％.与阳性药替莫唑胺治疗组相比,硝呋替莫各治疗组的综合治疗优势更为显著.结论 通过体内外实验结果的综合分析,证实硝呋替莫对SH-SY5Y(luc2/GFP)肾转移瘤模型裸鼠具有良好的治疗作用.

目的 构建表达荧光素酶(Luc)及绿色荧光蛋白(GFP)双标细胞因子诱导的杀伤性(CIK)细胞系.方法 体外原代培养C57BL/6小鼠CIK细胞,使用构建好的表达Luc及GFP的慢病毒载体包装重组慢病毒,感染培养第14天的CIK细胞,嘌呤霉素筛选2 w后,采用荧光倒置显微镜观察GFP表达情况,PCR、基因测序及体外活体成像系统对感染后的CIK细胞表达Luc进行验证.结果 Luc-GFP-CIK双标细胞系构建成功,能够稳定表达Luc及GFP.荧光倒置显微镜观察显示转染后CIK细胞形态正常且表达GFP;PCR和测序结果 显示转染后CIK细胞获得Luc基因;体外活体成像系统检测显示转染后CIK细胞表达Luc.结论 初步构建了简便、安全的双标CIK细胞系,该方法便于普及,可为CIK细胞在体内的进一步研究提供前期基础和实验工具.