人外周血B细胞来源于骨髓，是异质性的。EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)可在体外感染静止B细胞(naive B cells)，利用其潜伏基因表达产物改变B细胞生命周期，从而形成永生化B淋巴母细胞系(B lymphoblastoid cell lines，B-LCLs)，是近年来常用的B细胞永生化的有效方法。B-LCLs常被用作外周血B细胞的替代物和DNA的资源库，通过其单克隆抗体分泌功能、抗原提呈作用和相对稳定的遗传背景等广泛应用于生命科学的各个领域。

目的:探讨1个Hunter综合征家系的临床表型和遗传学特征，并为其构建永生化类淋巴母细胞系。方法:选取2022年7月就诊于西安市儿童医院的1例Hunter综合征患儿及其家系成员(2代共6人)作为研究对象。回顾性分析患儿的临床资料，对其进行家系全外显子组测序，对候选变异进行Sanger测序家系验证，并进行生物信息软件分析。通过EB病毒转染构建患儿及其父母的外周血B淋巴细胞永生化细胞系并进行酶活性分析。结果:患儿为5岁7月龄男性，表现为手足关节不能伸直、四肢关节大，3月龄出现疝气、舟状头、桶状胸等。患儿的舅舅表现为四肢关节不能伸直、听力差、失明、右侧腹股沟斜疝等。基因检测显示患儿及其舅舅均携带 IDS基因(NM_000202.8)c.823G>A(p.D275N)变异。生物信息学分析表明，D275是一个具有高度保守性的位点，D275N变异可能会影响蛋白质空间构象的稳定性，从而降低酶的催化活性。患儿及其父母的永生化类淋巴母细胞系在构建过程中细胞体积增大、呈不规则形状，周围存在毛刺状结构和聚团生长。患儿永生化类淋巴母细胞的IDS酶活值低于检测限。根据美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG)相关指南， IDS: c．823G>A(p.D275N)被评级为可能致病变异(PS3＋PM2_Supporting＋PM5＋PP1＋PP3)。 结论:IDS：c.823G>A考虑为该Hunter综合征患儿手足关节不能伸直、四肢关节大的遗传学病因。永生化细胞系的构建为进一步研究上述变异对IDS功能的影响提供了细胞模型。

目的:探讨B细胞易位基因1(BTG1)在SU-DHL-2细胞中的表达及其通过自噬对细胞增殖和凋亡的影响。方法:实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白印迹法分别检测人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系U2932、OCI-LY-10、SU-DHL-2以及B淋巴母细胞IM-9中BTG1 mRNA和蛋白表达量。SU-DHL-2细胞按照随机数字表法分为对照组、空载体组、BTG1过表达组、3-MA组和BTG1过表达＋3-MA组，细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖活性，流式细胞仪检测细胞凋亡率，蛋白印迹法检测微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3 Ⅱ)、酵母Atg6同系物(Beclin1)和自噬相关蛋白5(Atg5)表达量。多组间比较采用单因素方差分析(One way-ANOVA)，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:U2932、OCI-LY-10、SU-DHL-2细胞中BTG1 mRNA表达量(0.85±0.06、0.54±0.06、0.53±0.05)均低于IM-9细胞(1.22±0.16， t＝3.750、6.893、7.129， P<0.05)，蛋白表达量(0.70±0.08、0.54±0.06、0.24±0.04)均低于IM-9细胞(0.87±0.06， t＝2.944、6.736、15.132， P<0.05)。BTG1过表达组细胞增殖活性[(74.80±1.24)%]低于对照组(100.00%， t＝35.200， P<0.05)和空载体组[(98.35±1.02)%， t＝25.404， P<0.05]；BTG1过表达组细胞凋亡率[(14.74±0.93)%]高于对照组[(6.28±0.31)%， t＝14.948， P<0.05]和空载体组[(8.53±0.55)%， t＝9.955， P<0.05]；BTG1过表达组BTG1 mRNA表达量(2.33±0.08)高于对照组(1.03±0.06， t＝22.517， P<0.05)和空载体组(1.01±0.07， t＝21.508， P<0.05)，蛋白表达量(0.88±0.07)高于对照组(0.56±0.07， t＝5.599， P<0.05)和空载体组(0.61±0.06， t＝5.072， P<0.05)。BTG1过表达＋3-MA组细胞增殖活性[(84.21±3.26)%]高于BTG1过表达组[(73.42±3.48)%， t＝3.919， P<0.05]，细胞凋亡率[(18.40±2.26)%]低于BTG1过表达组[(26.79±2.80)%， t＝4.039， P<0.05]，LC3Ⅱ、Beclin1和Atg5蛋白表达量(0.56±0.05、0.72±0.07、0.49±0.05)低于BTG1过表达组(0.71±0.06、0.89±0.05、0.68±0.05， t＝3.326、3.423、4.654， P<0.05)。 结论:BTG1过表达可诱导自噬发挥抗弥漫大B细胞淋巴瘤作用。

目的:探讨钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂（SGLT2i）对2型糖尿病（T2DM）小鼠睾丸生精功能的影响。方法:将21只8周龄雄性 db/db小鼠按随机数表法随机分为3组（每组7只），分别为 db/db组［溶媒（水）干预］、达格列净（Dapa）组［达格列净（1 mg·kg -1·d -1）］和卡格列净（Cana）组［卡格列净（10 mg·kg -1·d -1）］，每日灌胃，干预5周，另选5只同窝 db/m小鼠作正常对照。监测所有小鼠的体重和血糖，干预结束后使用计算机辅助精子分析系统评价小鼠精液质量、HE染色评估睾丸组织形态学、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记（TUNEL）和免疫组化染色分析睾丸细胞凋亡情况。将小鼠精母细胞GC-2细胞系分为3组，分别为正常对照组（对照溶剂）、PA组（100 μmol/L棕榈酸）、PA+Dapa组（100 μmol/L棕榈酸联合30 μmol/L达格列净），干预48 h，使用免疫印迹法、流式细胞术及试剂盒检测细胞氧化应激及凋亡情况。采用单因素方差分析或Brown-Forsythe/Welch进行组间比较。 结果:与 db/db组相比，Dapa组和Cana组小鼠的空腹血糖、糖负荷后各时间点血糖水平均降低（均 P<0.05）；精子存活率和前向运动精子率均增加，曲线速度和平均路径速度均提升（均 P<0.05）；睾丸组织活化Caspase-3表达、TUNEL阳性生精小管比例和TUNEL阳性细胞比例均降低（均 P<0.05）。GC-2细胞中，与PA组相比，PA+Dapa组细胞内活性氧水平、丙二醛含量、细胞凋亡率均降低，超氧化物歧化酶活性、B细胞淋巴瘤2（BCL2）表达均增加（均 P<0.05）。 结论:SGLT2i改善T2DM小鼠生精功能障碍和精液质量下降，并通过减少睾丸组织氧化应激和凋亡发挥降糖非依赖的生殖系统直接保护作用。

目的:探究系别不确定的造血细胞肿瘤髓外肿块病理诊断与鉴别诊断要点，并提出诊断的建议。方法:选取较常见的5例系别不确定的造血细胞肿瘤，分别为髓系肉瘤、混合表型急性白血病，B/髓系、T淋巴母细胞淋巴瘤合并急性髓系白血病、急性未分化白血病合并皮肤成熟浆样树突细胞增殖及早期前驱T细胞急性淋巴细胞白血病，收集其形态学、免疫组化检测、流式细胞术结果，探究系别不确定的造血细胞肿瘤诊断中存在的问题及鉴别诊断。结果:5个病例提示系别不确定的造血细胞肿瘤准确的病理诊断和分型需要：①基于系别特异性标志物；②系别不确定的造血细胞肿瘤细胞具有多向分化潜能，不同部位或不同时期肿瘤细胞分化方向有所不同，初诊及病情变化时需多次活检并全面标记各系相关标志物以协助诊断；③常规病理形态学及组织的免疫表型检测在诊断系别不确定的造血细胞肿瘤时存在局限性，需要结合形态学、流式细胞术检查等综合分析。结论:系别不确定的造血细胞肿瘤来源于具有多向分化潜能的造血干细胞，肿瘤细胞分化存在多样性，需要结合细胞形态学、流式细胞术、病理检查、临床特征、分子遗传学等进行诊断。

目的:探讨miR-200c-3p对肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞株增殖与凋亡的调控作用。方法:收集2015年1月至2019年8月深圳市儿童医院收治肾母细胞瘤患儿新鲜的瘤组织和瘤旁肾组织30例。实验分为模拟物阴性对照组、miR-200c-3p组及miR-200c-3p抑制剂组。采用实时荧光定量PCR法检测30例配对的肾母细胞瘤肿瘤组织、瘤旁肾组织及肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞和人胚肾293FT细胞系中miR-200c-3p的表达情况。采用细胞计数盒8(CCK-8)细胞增殖实验测定miR-200c-3p抑制SK-NEP-1细胞增殖的效果，流式细胞术检测miR-200c-3p对SK-NEP-1细胞周期及凋亡的影响。裸鼠原位移植实验检测miR-200c-3p过表达对体内成瘤的影响，对瘤体组织进行HE染色并病理形态的观察、免疫组织化学染色检测移植瘤组织中核增殖指数Ki-67的增殖情况；Western blot法检测3组裸鼠移植瘤组织中B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)及活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved Caspase-3)的表达水平。结果:30例患儿miR-200c-3p的表达水平在肾母细胞瘤组织(0.420±0.587)中明显低于配对的瘤旁肾组织(1.500±0.504)( t＝8.613， P<0.001)。miR-200c-3p的表达水平在SK-NEP-1细胞中(0.363±0.006)与人胚肾293FT细胞(0.807±0.186)比较也显著下降( t＝4.136， P<0.05)。CCK-8法表明按照组间和时间交互效应miR-200c-3p可抑制SK-NEP-1细胞体外增殖( F＝16.81， P<0.001)。流式细胞术检测肾母细胞瘤细胞周期与凋亡显示，miR-200c-3p能使SK-NEP-1细胞阻滞在G0/G1期及S期( t＝-7.770， P<0.01； t＝11.501， P<0.001)，且促进早期凋亡率增加，晚期凋亡率降低( t＝-22.270， P<0.001； t＝4.612， P<0.01)。裸鼠原位移植实验显示与模拟物阴性对照组比较，miR-200c-3p组肿瘤体积[(2.469±0.914) cm 3比(0.419±0.16) cm 3]明显缩小( t＝5.407， P<0.001)，而miR-200c-3p抑制剂组[(1.627±0.189) cm 3]差异不明显( t＝2.209， P＝0.052)。Western blot实验示miR-200c-3p上调了凋亡蛋白cleaved Caspase-3和Bax的表达水平( t＝-47.000、-82.730，均 P<0.001)，但下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平( t＝53.740， P<0.001)。 结论:miR-200c-3p能抑制SK-NEP-1细胞增殖及促进细胞凋亡，抑制裸鼠移植瘤的生长并起到抑癌基因的作用。

目的 探究miR-760对急性淋巴细胞白血病(ALL)凋亡和增殖的影响和机制.方法 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-760和细胞质多腺苷酸化元件结合蛋白2(CPEB2)相对表达.Ball-1细胞分为不同组:miR-NC组(转染miR-NC)、miR-760mimic组(转染miR-760 mimic)、si-NC组(转染si-NC)、si-CPEB2组(转染si-CPEB2)、oe-NC组(转染oe-NC)、oe-CPEB2组(转染oe-CPEB2)、miR-760 mimic+oe-NC组(共转染miR-760 mimic+oe-NC)和miR-760 mimic+oe-CPEB2组(共转染miR-760 mimic+oe-CPEB2).流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Bax、c-caspase-3、t-caspase-3、Ki67、PCNA和CPEB2相对表达量.双荧光素酶报告实验验证miR-760和CPEB2靶向结合.结果 与人B淋巴母细胞HMy2.CIR比较,ALL细胞系Ball-1、Reh和JurkatE6中miR-760水平表达下降,CPEB2 mRNA和蛋白水平表达上升(P<0.05).与miR-NC组比较,miR-760 mimic组细胞凋亡率、Bax和c-caspase-3水平表达上升,而Ki67和PCNA水平表达下降(P<0.05).生物信息学方法预测miR-760靶向调控CPEB2,双荧光素酶报告实验验证CPEB2是miR-760的靶标.与si-NC组比较,si-CPEB2组细胞凋亡率、Bax和c-cas-pase-3水平表达上升,而Ki67、PCNA水平表达下降(P<0.05).上调CPEB2表达能逆转miR-760过表达对细胞凋亡率、Bax、c-caspase-3的促进和对Ki67、PCNA的抑制(P<0.05).结论 miR-760靶向调节CPEB2,诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖,为ALL治疗提供新选择.

目的:构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和荧光素酶(luciferase,Luc)双标记的EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染的人B淋巴母细胞系(B lymphoblastoid cell lines,B-LCL)应用于 肿瘤模型,并比较尾静脉注射和皮下注射人B-LCL细胞建立小鼠模型的优缺点.方法:通过二代慢病毒转染、嘌呤霉素筛选构建GFP/Luc双标的B-LCL细胞系(B lympho-blastoid cell lines double-tagged with GFP and Luc,B-LCL-GL),接种低、中和高 3种剂量的细胞至 NPG[(NOD)/Prkdcscid/IL-2Rγnull]小鼠皮下或尾静脉内,建立皮下移植瘤模型与血行性转移瘤模型并成像分析.结果:B-LCL-GL细胞中的GFP 阳性细胞比例为 92.5%,荧光素酶平均发光强度为 4.80E+08 Photons/s,远高于B-LCL组.在血行性转移瘤模型中,连续成像结果表明从第 7天到第 28天随着肿瘤移植时间的延长,肿瘤最先定植在腹腔后又转移到全身.在皮下移植瘤模型中,第 7天时 3组小鼠均可以检测到肿瘤细胞在小鼠皮下接种处发出了中心强、周围弱的荧光信号,第 28天时高剂量组肿瘤转移到全身.相同接种剂量分别通过尾静脉和皮下接种时,肿瘤生物发光均无显著性差异(P>0.05);小鼠存活情况显示低、中、高各剂量尾静脉注射组在第100天时全部死亡,低剂量和中剂量皮下注射组小鼠带瘤生存长达 100天且未出现小鼠死亡,可允许更长时间进行实验.结论:成功构建GFP/Luc双标的B-LCL细胞系,尾静脉注射和皮下注射异种移植B-LCL细胞两种方法均可成功建立EBV-LCLs肿瘤模型,并可通过成像示踪定位和精准定量肿瘤大小,为肿瘤特性研究及抗肿瘤药物筛选提供了研究平台.

目的 Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus,EBV)在淋巴瘤的发生发展中发挥重要作用,EBV相关淋巴瘤预后较差,在临床治疗过程中面临挑战.本研究旨在体外培养获得EBV抗原特异性T细胞,检测其功能及体外抗肿瘤能力.方法 采集2015-02-22-2016-05-01北京大学肿瘤医院淋巴瘤科10例结外NK/T细胞淋巴瘤患者外周血,分离获得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),体外培养获得EBV抗原特异性T细胞.检测特异性T细胞比例,测定EBV抗原特异性T细胞对自体淋巴母细胞系(lymphoblastoid cell lines,LCL)杀伤作用以及对来自EB病毒潜伏膜蛋白1(Epstein-Barr virus latent membrane protein1,LMP1)、LMP2和EB病毒核抗原1(Epstein-Barr virus nuclear antigen,EBNA1)不同部位肽段的反应性.结果 采集10例EBV阳性NK/T细胞淋巴瘤患者外周血,体外培养发现随时间延长,抗原特异性T细胞比例升高.培养2周后的EBV抗原特异性T细胞,在再次遭遇抗原后,效应细胞比例可以达到(6.837±1.031)％,与阴性对照(1.447±0.566)％相比较,差异有统计学意义,t=5.622,P=0.001.EBV抗原特异性T细胞可以识别已经证实的LMP2表位.抗原特异性T细胞中同时含有EBV抗原反应性CD4和CD8细胞.体外杀伤试验证实,EBV抗原特异性T细胞能够杀伤患者自体来源的EBV病毒转化的B细胞产生淋巴母细胞细胞系(lymphoblastoid cell lines,LCL),但对人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)不相合的异体LCL却不具备杀伤活性,即具有HLA限制性.结论 EBV抗原特异性T细胞有可能用于治疗EBV相关淋巴瘤,为后续开展相关体内研究提供理论基础.

通过脂质体法转染pCMV6-CD40L重组质粒和G418阳性克隆筛选,构建了稳定表达CD40L的NIH3T3细胞系,在RNA和蛋白质水平进行了功能鉴定,对其作为饲养细胞在体外B淋巴母细胞系(B lymphoblastoid cell lines,B-LCLs)培养和在EBV转化B细胞中的作用进行了实验验证.结果表明,NIH3T3-CD40L细胞系不仅可以提高体外低密度B-LCLs存活率,而且可以降低成功建立B-LCLs所需的细胞密度,促进其增殖.该细胞系的成功构建,进一步确证了NIH3T3-CD40L作为饲养细胞可以促进体外低密度B-LCLs的增殖及提高EBV转化B淋巴细胞的效率,优化了体外B细胞培养及EBV转化B淋巴细胞的流程,也为单克隆抗体的制备奠定了基础.