目的:对四川省一例由野生动物(猪獾)咬伤发病的疑似狂犬病病例的唾液标本进行狂犬病病毒的全基因组序列测定，从分子水平对病毒进行遗传变异特征分析，了解四川省野生动物狂犬病病毒的流行和变异情况。方法:从疑似狂犬病病例的唾液标本中提取总病毒RNA，采用PCR的方法以特异性引物进行狂犬病病毒序列扩增，将获得的基因片段进行测序，并运用生物学软件将所得序列进行拼接从而得到狂犬病病毒株的全基因组序列。对全基因组进行遗传变异特征分析。结果:经测序获得1株猪獾源狂犬病病毒(以下简称SCR23-052)全基因组核苷酸序列，经NCBI在线BLAST及与多个参考序列比对表明，SCR23-052全基因组序列的组成和结构符合弹状病毒科狂犬病毒属特征；分别与宁夏毒株(J)、重庆毒株(CQ92、02050CHI)之间各个基因区域核苷酸与氨基酸序列相似性最高，SCR23-052基因组序列差异性在氨基酸水平明显低于核苷酸水平，说明蛋白质编码基因的核苷酸变异大多属于同义突变。种系发生分析显示SCR23-052属于基因V型，其糖蛋白主要抗原位点未见明显突变，在线网址预测糖蛋白在第56和338位发生了氨基酸糖基化，SCR23-052与参考疫苗株CTN181的信号肽序列相比氨基酸差异最少。本研究病毒在核蛋白主要抗原位点与所有参考疫苗株均发生了相同的突变(332位A→T)，在B细胞表位仅与参考疫苗株CTN181相比发生了379位L→V的突变，SCR23-052与基因Ⅴ型的参考毒株在核蛋白研究位点均一致。结论:获得了1株野生动物猪獾源基因V型狂犬病病毒株全基因组序列，不同于四川以往报道流行的犬源狂犬病病毒基因I型毒株。SCR23-052与各参考株基因组序列相比有不同程度差异，但主要毒力特征未改变。

目的:获取具有生物活性的狂犬病病毒核蛋白在大肠埃希菌表达系统中高效表达。方法:实验使用密码子优化技术重新编码狂犬病病毒CTN-1株核蛋白基因，人工合成全长基因并克隆至pET-43.1a表达载体，在大肠埃希菌BL21(DE3)株中诱导表达，并使用Western blot检测其反应原性。结果:诱导后SDS-PAGE分析显示在相对分子质量50×10 3处出现明显的表达条带，与预期蛋白质条带大小一致。其中在大肠埃希菌 A600为0.5左右，37℃诱导5 h时表达产量最高(约为32.3%)。大量表达时核蛋白的表达形式主要为包涵体，后经Ni 2+螯合层析纯化，获得纯度为95%以上的目的蛋白。纯化产物经Western blot鉴定，与疫苗免疫小鼠血清呈阳性反应，表明大肠埃希菌表达CTN-1株核蛋白具有生物活性。 结论:本实验成功建立了CTN-1株核蛋白在大肠埃希菌表达系统的高效表达方法，并获得了高纯度目的蛋白，为进一步的临床诊断和新型疫苗制备提供基础资料。

目的:评价从噬菌体库筛选获得的1株抗狂犬病病毒单克隆抗体的基本特征。方法:从抗狂犬病病毒噬菌体库中筛选获得1个阳性克隆，扩增获得其抗体轻重链可变区，构建全分子抗体的表达质粒后在HEK293 EBNA1细胞中瞬时表达，亲和纯化后对该抗体进行体外抗狂犬病病毒中和活性、中和指数、逃逸株测序、差示扫描荧光法热稳定性分析，并与数据库中街毒株糖蛋白比对关键氨基酸位点。结果:该抗体体外抗狂犬病病毒中和活性为691IU/mg；该抗体对狂犬病病毒CVS-11和CTN株的中和指数分别为8.52和7.05；CVS-11逃逸株糖蛋白测序分析表明，该抗体针对的关键氨基酸主要为N37 K、N194 K和K205 N。与1 338株狂犬病病毒街毒株糖蛋白基因比对表明，37、194和205位上仅有1个街毒株在194位上与突变逃逸株氨基酸类型相同。该抗体Tm值为70.58±0.31 ℃。结论:获得1株高中和指数的全分子人源抗狂犬病病毒中和抗体，该抗体具有较好的热稳定性。

目的 测定1株由野猪致人感染狂犬病病毒的全基因组序列,分析其系统进化和分子特征,了解四川省野生动物携带狂犬病病毒的分子流行病学现状.方法 对2020年收集的1例狂犬病病例唾液标本提取病毒核酸后采用逆转录PCR法合成cDNA,再以特异性引物扩增病毒全基因组序列并测序.利用BioEdit 7.0软件对全基因组核苷酸序列和推测的氨基酸序列进行比对分析,利用Mega 7.0软件进行系统进化分析并绘制种系发生树.结果 获得 1条全长为11 881 bp的狂犬病病毒全基因组序列(SCR20-093).系统进化和同源性分析显示,SCR20-093属于China Ⅰ型,其与中国目前主要流行株的N基因核苷酸和氨基酸同源性分别为85.2％～99.9％和92.6％～99.7％,其中与四川毒株(SCR13-309)的核苷酸和氨基酸同源性均最高,进化关系最近.在全基因组水平上与国内外重要疫苗株相比,SCR20-093与我国疫苗株CTN-1的亲缘关系最近,同源性最高.重要功能位点分析显示,SCR20-093相较于疫苗株的主要功能位点相对保守,但在N、G基因中存在抗原位点差异.结论 获得1株野猪致人感染狂犬病病毒全基因组序列,为China Ⅰ型,与四川省常年流行的狂犬病病毒株分型一致.SCR20-093与疫苗株相比,部分抗原位点存在差异,但主要毒力和抗原性未改变.

目的 建立150 L生物反应器大规模培养狂犬病病毒(rabies virus,RABV)的工艺,为后期开发更大规模高密度微载体反应器工艺奠定基础.方法 应用30 L(型号:C30-2)和150 L(型号:VESSEL FERMENTER 300L)生物反应器,以灌流方式培养Vero细胞和CTN-1V株RABV,Cytodex-1微载体浓度20g/L,培养温度36～38 ℃,DO 20％～60％,pH 7.0～7.4,连续13 d收获病毒液,培养过程中取样检测细胞密度、病毒滴度,并对病毒收获液进行无菌和支原体检查及抗原、宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、DNA残留量检测.结果 30和150 L生物反应器的细胞培养密度均可达1.2×107个/mL以上,在培养过程中各时间点的细胞密度差异均无统计学意义(t=0.225～2.173,P=0.096～0.833).2种规模生物反应器病毒收获液均在感染后6 d达最高病毒滴度(8.5 lgLD50/mL),且差异无统计学意义(t=1.000,P=0.374).2种规模生物反应器病毒收获液的抗原、HCP、BSA和DNA残留量基本一致.结论 可用150 L生物反应器大规模培养RABV,病毒收获液符合《中国药典》三部(2020版)相关标准.

目的 以水庖性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)为载体,构建表达狂犬病病毒(rabies virus,RV)G蛋白的嵌合型重组VSV.方法 将VSV骨架质粒G基因替换为狂犬病疫苗CTN-1株G基因,与分别表达T7聚合酶及VSV N、P、L蛋白的辅助质粒共转染293T细胞,获得重组病毒.通过RT-PCR、免疫荧光法和Western blot检测RV G基因和G蛋白表达.将重组病毒在Vero细胞上传代培养,检测不同代次病毒滴度并绘制病毒生长曲线.结果 成功获得了重组病毒VSV-RVG,RT-PCR结果表明重组病毒基因组中成功插入了 RV G基因,免疫荧光法和Western blot可检测到RVG蛋白的表达.重组病毒连续传代5次,病毒滴度稳定在7.5～8.51gTCID50/mL之间.结论 成功构建了表达RVG蛋白的嵌合型重组VSV,重组病毒具有良好的遗传稳定性,为以VSV为载体的反向遗传学技术平台的构建奠定了基础.

采用狂犬病病毒株CTN-1V株接毒于人二倍体细胞Walvax-2株进行病毒收获液制备工艺研究.接毒时,采用不同的人二倍体细胞量、不同的接毒方式及不同的moi进行比较;接毒后,待带毒细胞长至致密单层即95％以上,采用直接换病毒维持液和带毒传一代后再换维持液的方式进行比较;同时采用不同培养基维持液、不同pH值的维持液及对不同的病毒收获时间进行比较;通过测定病毒收获液的滴度来确定狂犬病病毒株CTN-1V株接毒于人二倍体细胞Walvax-2株上的病毒收获液最适制备工艺条件.接毒时,采用人二倍体细胞量≥2亿,37℃悬浮混合吸附30 min的方式及0.05 moi;接毒后采用美迪DMEM +0.3％人血白蛋白作为病毒维持液、pH为7.8～8.0的维持液及从换维持液d3开始收获病毒液,并换上新的维持液,之后再进行5d及7d病毒液的收获,通过动物法和细胞法测定收获液的病毒滴度,3次收获液的病毒滴度均大于7.0 lg LD50/mL.建立起了稳定的狂犬病病毒株CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株上的病毒收获液制备工艺.

目的 对中国狂犬病疫苗株CTN-1、PV-2061全基因组序列进行分析.方法 通过RT-PCR法获取CTN-1和PV-2061株主种子批的全基因组序列,与国内分离的全基因组序列进行比对,并对狂犬病病毒主要抗原进行比对分析.结果 CTN-1和PV-2061株具有较高的同源性,CTN-1株与我国街毒株的亲缘关系更近,符合作为疫苗候选株的要求.PV-2061株在氨基酸序列中具有独特的突变,推测与中和抗体的产生相关.结论 对中国狂犬病疫苗株CTN-1、PV-2061全基因组进行了多重比对,为研制安全高效的狂犬病疫苗奠定了理论基础.

目的:制备两株抗人心肌肌钙蛋白 I(human cardiac troponin I,cTn I)单克隆抗体,建立鲁米诺化学发光酶免疫分析法.方法:制备腹水型单抗、饱和硫酸铵沉淀法和亲和层析柱Protein G纯化抗体,并通过SDS-PAGE和ELISA对抗体特异性进行鉴定,建立鲁米诺化学发光酶免疫分析法,并对30份临床血清样本进行检测.结果:本实验制备的两株单抗(分别命名为Ab1、Ab3;亚型都是IgG1)能够识别以cTn I单体、cTn I-C复合物和cTn I-T-C复合物不同形式存在的cTn I.Ab1、Ab3的效价分别为1:80万和1:40万,亲和力常数分别为1.62×109L/mol、2.60×108L/mol.利用2株单抗建立的鲁米诺化学发光酶免疫分析法检测范围为:6.25 ~400 ng/ml.对30份临床样本进行检测,阳性检出率为77.3%,阴性检出率为100%.结论:建立了可以检测以cTn I单体、cTn I-C和cTn I-T-C复合物形式存在的cTn I的鲁米诺化学发光酶免疫分析法,具有更高的实用性.

目的 评价国产CTN-1V株人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在10～60岁健康人群中的安全性和免疫原性.方法 采用随机、盲法、同类制品平行对照的设计,将900名受试者按2∶1随机配对分别接种试验疫苗及对照疫苗,观察安全性;所有受试者于首剂免前和免后14及45 d采集静脉血,通过快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)测定血清中狂犬病病毒中和抗体滴度,计算几何平均浓度水平(GMC).结果 试验组与对照组不良反应发生率分别为32.33％和38.67％,试验组明显低于对照组(P＜0.05).局部反应主要为接种部位疼痛、发红、肿胀、瘙痒,全身反应主要为发热、头痛、乏力等,大部分为轻度(1级).免后14、45 d试验组的狂犬病病毒中和抗体阳转率均为100.00％,抗体GMC分别为9.96和28.83 IU/mL,且与对照组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 国产CTN-1V株人用狂犬病疫苗(Vero细胞)具有良好的安全性和免疫原性.