目的:研究神经前体细胞表达发育调控样基因4(neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated gene 4-like， NEDD4 L)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)复制的影响及其可能的分子机制。 方法:采用Lipofectamine2000分别将靶向 NEDD4 L的小干扰RNA、 NEDD4 L的过表达质粒(pcDNA3.1- NEDD4 L-HA)、HBV复制质粒(pGEM-HBV1.3)和poly(dAT：dAT)瞬时转染至HepG2细胞，并以可稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞为对照。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测 NEDD4 L、α干扰素、β干扰素、干扰素刺激基因56(interferon-stimulated gene 56， ISG56)、黏液病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A, MxA)、寡腺苷酸合成酶(oligoadenylate synthetase， OAS)等的mRNA水平，以及HBV DNA和3.5 kb HBV RNA的表达水平；采用蛋白质印迹法验证NEDD4L沉默或过表达效果，并检测相关信号分子的蛋白质水平；采用酶联免疫吸附测定法检测细胞上清液中β干扰素产量。统计学方法采用 t检验。 结果:HepG2.2.15细胞中的NEDD4L mRNA和蛋白质水平分别为10.53±0.47和4.17±0.43，分别高于HepG2细胞中的1.00±0.05和1.26±0.25，差异均有统计学意义( t＝3.27， P＝0.008； t＝1.68， P＝0.030)。在敲减 NEDD4 L基因表达的细胞中，上清液HBV DNA表达水平为0.32±0.09，低于对照组的1.00±0.05，差异有统计学意义( t＝－0.93， P＝0.020)；3.5 kb HBV RNA表达水平为0.49±0.11，低于对照组的1.00±0.05，差异有统计学意义( t＝－0.68， P＝0.040)。与对照组相比， NEDD4 L敲减组的β干扰素、 ISG56、 MxA和 OAS的mRNA相对表达水平均上升，差异均有统计学意义( t＝4.66、9.38、7.29、7.01，均 P<0.01)。 NEDD4 L敲减组β干扰素含量在poly(dAT：dAT)处理和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)刺激时分别为(776.41±115.49) ng/L和(961.21±130.19) ng/L，分别高于对照组的(320.15±56.05) ng/L和(440.17±67.82) ng/L，差异均有统计学意义( t＝2.43， P＝0.020； t＝2.85， P＝0.030)； NEDD4 L过表达组β干扰素含量在poly(dAT：dAT)处理和VSV刺激时分别为(156.18±26.47) ng/L和(176.67±34.51) ng/L，分别低于对照组的(320.38±49.39) ng/L和(440.59±68.83) ng/L，差异均有统计学意义( t＝－2.03， P＝0.040； t＝－1.93， P＝0.030)。HBV复制下调了β干扰素上游黑色素瘤分化相关蛋白5(melanoma differentiation-associated protein 5，MDA5)的蛋白质水平，而该下调作用在敲减 NEDD4 L的细胞中并不明显。 结论:HBV复制能通过促进细胞NEDD4L的表达，下调MDA5而抑制β干扰素的产生，进而辅助HBV的固有免疫逃逸。

目的 构建1条新的人集成干扰素α(consensus interferon α,cIFNα)序列,并验证其抗病毒效果.方法 综合57条人源IFNα序列,经软件比对分析选出各个位点保守氨基酸偏好性,人工合成新的cIFN序列hIC至pUC-57载体中,与pCK连接,构建真核表达载体pCK-hIC,转染293T细胞表达目的蛋白hIC;于增强型绿色荧光蛋白水疱性口炎病毒(enhanced green fluorescent protein vesicular stomatitis virus,VSV-EGFP)感染 A549 细胞前后用其孵育细胞,经荧光观察、结晶紫染色和流式细胞术体外分析hIC对VSV-EGFP复制的影响,并通过qPCR法验证IFN下游基因的表达.结果 质粒pCK-hIC经双酶切及测序鉴定证明构建正确.表达的hIC蛋白相对分子质量约27 000,能明显降低VSV-EGFP的荧光表达,明显抑制病毒增殖,并可激活IFN刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)、2'-5'寡腺苷酸合成酶 1(2'-5'-oligoadenylate synthetase 1,OAS1)、IFN 诱导跨膜蛋白(interferon-inducible transmembrane protein,IFITM)的表达.结论 hIC具有良好的抗病毒效果,为后续研究及开发奠定了基础.

目的:探究野生型水疱性口炎病毒印第安纳株(VSV-IN)对小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞移植模型小鼠的免疫调节及肿瘤转移的影响.方法:VSV以MOI=1、MOI=10、MOI=100感染4T1细胞12、24、48 h后,CCK-8法检测4T1细胞死亡率,划痕愈合实验检测细胞迁移能力,qPCR检测细胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9 mRNA的表达.于雌性BALB/c小鼠脂肪垫接种1×106个/mL的4T1细胞0.1 mL,构建4T1细胞荷瘤小鼠模型,待小鼠肿瘤体积达200 mm3,分别向移植瘤内注射PBS、紫杉醇(TAX)(15 mg/kg)、VSV-IN(1×106 pfu/只),每周1次.给药4次后,处死小鼠、剥离完整移植瘤组织,测量肿瘤体积及质量,肺组织病理切片经H-E染色后观察肿瘤肺部转移结节,流式细胞术检测脾组织中T细胞亚群比例,ELISA法检测小鼠血清IL-6及TNF-α水平,利用GEPIA在线分析乳腺肿中迁移相关蛋白mRNA的表达,免疫组化法检测肿瘤中MMP-2、MMP-9与E-cadherin的表达,利用蛋白-蛋白对接技术预测VSV-IN的G蛋白、M蛋白与ERK2、E-cadherin的亲和力.结果:经MOI=10、100的VSV-IN处理48 h后,4T1细胞死亡率显著高于对照组(均P<0.01);与对照组相比,VSV-IN组(MOI=10)细胞迁移率明显降低(P<0.01),MMP-9 mRNA的相对表达量明显降低(P<0.05);与对照组小鼠相比,VSV-IN组移植瘤生长较对照组减缓且终点体积显著减小(P<0.05),VSV-IN组小鼠肺转移结节数量显著减少[(12.86±1.86)vs(24±3.67)个,P<0.01],脾内CD4+T、CD8+T细胞比例显著升高(均P<0.05),血清TNF-α、IL-6含量显著升高(均P<0.01);GEPIA分析发现在乳腺癌中E-cadherin、MMP-9表达水平均高于癌旁组织(P<0.05);VSV-IN组小鼠肿瘤细胞内MMP-9表达明显低于对照组(P<0.05);VSV-IN的G、M蛋白与ERK2的结合自由能分别为-11.7 kcal/mol、-6.4 kcal/mol.结论:野生型VSV-IN可抑制4T1细胞荷瘤小鼠的移植瘤生长及转移,这可能与其促进抗肿瘤免疫及调控迁移相关蛋白表达有关.

目的 探索土木香内酯体内外的抗病毒作用,并基于Ⅰ型干扰素(type Ⅰ interferon,IFN-Ⅰ)通路探究其抗病毒作用机制.方法 CCK-8法检测土木香内酯对A549细胞活力的影响;利用表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus expressing green fluorescent protein,VSV-GFP)感染细胞模型,结合流式细胞术检测土木香内酯对病毒复制的影响;qRT-PCR检测土木香内酯对甲型流感病毒(influenza A virus,H1N1)、脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)复制的影响;Western blotting检测土木香内酯对VSV病毒G蛋白和H1N1病毒NP蛋白表达的影响;利用生物信息学初步分析土木香内酯的抗病毒分子机制;qRT-PCR检测药物处理后干扰素α1(interferon α1,Ifna1)、干扰素β1(interferonβ1,Ifnb1)、干扰素诱导蛋白1(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1,Ifit1)、干扰素刺激基因 15(interferon stimulated gene 15,Isg15)的mRNA表达变化;流式细胞术和qRT-PCR检测 Ⅰ型干扰素受体1(type Ⅰ interferon receptor 1,IFNAR1)敲除(Ifnar1-/-)细胞中,土木香内酯的抗病毒作用与干扰素信号通路的关系;构建小鼠H1N1病毒滴鼻感染模型探究土木香内酯的体内抗病毒作用.结果 土木香内酯体外抑制VSV、H1N1和EMCV病毒复制;土木香内酯激活IFN-Ⅰ信号通路;在Ifnar1-/-细胞中土木香内酯抗病毒作用被削弱;土木香内酯提高H1N1感染小鼠的存活率,降低脏器H1N1病毒载量.结论 土木香内酯激活基于IFN-I信号通路的抗病毒天然免疫反应,发挥抵抗多种病毒复制的作用.

目的 研究异土木香内酯的体外抗病毒作用及机制.方法 CCK-8法检测0.125、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000、32.000、64.000 μmol·L-1的异土木香内酯处理24h对人非小细胞肺癌细胞系(A549)细胞活力的影响;表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(VSV-eGFP)以0.02的感染复数(MO1)感染A549细胞制备模型,流式细胞术检测共同孵育12h的异土木香内酯5、10、20μmol·L-1对GFP阳性细胞率的影响;VSV感染(MOI=0.1)A549细胞,Western blotting检测异土木香内酯处理16h对VSV病毒G蛋白表达的影响;分别使用甲型流感病毒(H1N1,MOI=0.1)、脑心肌炎病毒(EMCV,MOI=0.1)感染A549细胞,同时给药共同孵育8h后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测土木香内酯对病毒RNA表达的影响;异土木香内酯分别以预处理12 h、病毒吸附过程中给药2 h、病毒吸附后给药10h3种不同方式给药,通过流式细胞术检测其对VSV-eGFP在A549细胞中复制的影响;异土木香内酯20 μmol·L-1处理胚胎成纤维(MEF)细胞12h,进行转录组测序分析;异土木香内酯5、10、20μmol·L-1处理MEF细胞12 h,qRT-PCR检测干扰素α1(Ifna1)、干扰素β1(Ifnb1)、干扰素诱导蛋白44(Ifi44)、干扰素刺激基因15(Isg15)的mRNA表达.结果 异土木香内酯对A549细胞的半数抑制浓度(IC50)为51.01μmol·L-1;与模型组比较,流式结果显示异土木香内酯显著减少VSV-eGFP阳性细胞率(P＜0.001),但对病毒的吸附过程没有影响,药物预处理及吸附后给药显著抑制VSV病毒复制(P＜0.01、0.001);qRT-PCR结果显示异土木香内酯显著降低H1N1、EMCV病毒的mRNA水平(P＜0.001);Western blotting结果显示异土木香内酯显著抑制VSV的G蛋白表达(P＜0.001);转录组测序分析和qRT-PCR结果表明,异土木香内酯促进Ⅰ型干扰素通路的激活,并诱导Ifnia1、Ifnb1、Ifi44、Isg15(P＜0.001)表达.结论 异土木香内酯通过促进基于干扰素通路的抗病毒天然免疫激活,发挥抑制病毒复制的作用.

目的 探讨细胞外基质蛋白ABI3BP对水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)基因组复制和先天免疫信号通路的影响.方法 在人皮肤成纤维细胞BJ-5ta中转染小干扰RNA(siRNA)敲低ABI3BP基因,建立ABI3BP基因缺失的VSV-GFP病毒感染细胞模型.通过鬼笔环肽细胞免疫荧光实验,检测敲低ABI3BP后细胞内肌动蛋白(F-actin)形态结构的变化.在ABI3BP基因缺失的VSV-GFP病毒感染细胞模型上,利用RT-qPCR方法检测细胞中病毒mRNA水平的变化.利用免疫印迹法(Western blotting)检测IRF3和TBK1磷酸化水平的变化.结果成功建立敲减ABI3BP基因的VSV-GFP感染的细胞模型.鬼笔环肽细胞免疫荧光染色表明,敲减ABI3BP基因后,细胞内F-actin的表达发生结构重排.采用不同剂量的病毒感染细胞,与对照组相比,ABI3BP敲低细胞中基因拷贝数分别增加2.5～3.5倍(P＜0.01)和2.2～4倍(P＜0.01),VSV-GFP病毒蛋白表达水平显著上调;在ABI3BP基因敲低的细胞模型上,VSV-GFP病毒感染导致Ⅰ型干扰素免疫通路关键免疫分子p-IRF3和p-TBK1蛋白磷酸化水平明显下调.结论本研究表明细胞外基质蛋白ABI3BP对维持细胞内F-actin纤维网状结构具有重要作用.ABI3BP缺失促进RNA病毒的复制,ABI3BP是Ⅰ型干扰素通路激活的重要调控分子.

目的 探讨真核翻译延伸因子1A1(eEF1A1)对水疱性口炎病毒(VSV)和单纯疱疹病毒(HSV-1)复制的影响,以确定一个广谱抗病毒新靶点.方法 在人皮肤成纤维细胞(BJ-5ta)中转染小干扰RNA(si-eEF1A1)抑制eEF1A1表达,同时设置阴性对照组,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)与Western印迹法检测转染效率,制备eEF1A1基因沉默的细胞模型.用VSV感染细胞模型,检测细胞内VSV的基因拷贝数和蛋白水平;用HSV-1感染细胞模型,检测细胞内HSV-1的mRNA水平和蛋白水平.用聚胞苷酸[poly(I:C)]或脱氧核糖核酸钠盐(HT-DNA)分别转染细胞模型,RT-qPCR检测干扰素β(IFN-β)、趋化因子10(CXCL10)和干扰素刺激基因56(ISG56)的mRNA水平,Western印迹法检测干扰素调节因子3(IRF3)和TANK结合激酶1(TBK1)蛋白磷酸化水平.结果 与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组eEF1A1的mRNA水平和蛋白水平显著降低(P<0.01),eEF1A1基因沉默的细胞模型构建成功.与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组的VSV基因拷贝数下降70%～80%,VSV蛋白水平显著降低(P<0.01);HSV-1的mRNA水平下降50%～60%,HSV蛋白水平显著降低(P<0.01).poly(I:C)或HT-DNA刺激后,与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组的IFN-β、ISG56和CXCL10的mRNA水平以及IRF3与TBK1的蛋白磷酸化水平无显著差异.结论 eEF1A1调控VSV和HSV-1病毒复制,提示eEF1A1对RNA病毒和DNA病毒具有潜在的广谱调控作用,且可能不通过胞内核酸识别激活的免疫通路.

目的 以水庖性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)为载体,构建表达狂犬病病毒(rabies virus,RV)G蛋白的嵌合型重组VSV.方法 将VSV骨架质粒G基因替换为狂犬病疫苗CTN-1株G基因,与分别表达T7聚合酶及VSV N、P、L蛋白的辅助质粒共转染293T细胞,获得重组病毒.通过RT-PCR、免疫荧光法和Western blot检测RV G基因和G蛋白表达.将重组病毒在Vero细胞上传代培养,检测不同代次病毒滴度并绘制病毒生长曲线.结果 成功获得了重组病毒VSV-RVG,RT-PCR结果表明重组病毒基因组中成功插入了 RV G基因,免疫荧光法和Western blot可检测到RVG蛋白的表达.重组病毒连续传代5次,病毒滴度稳定在7.5～8.51gTCID50/mL之间.结论 成功构建了表达RVG蛋白的嵌合型重组VSV,重组病毒具有良好的遗传稳定性,为以VSV为载体的反向遗传学技术平台的构建奠定了基础.

抗病毒药物、中和抗体和预防性疫苗是应对新发、再发高致病性和高感染性病毒(如新冠病毒)最有效的策略.然而,涉及上述活病毒的实验操作必须在包含生物安全3级和4级设施的实验室中开展.为了便于评估上述抗病毒制品,研究者开发了基于人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)骨架的假病毒包装系统.该系统同时包含靶标病毒的囊膜蛋白表达质粒,使包装好的假病毒具备与野生型病毒相似的受体吸附和膜融合功能.鉴于此,在特定的包装系统中,囊膜蛋白的包装过程对假病毒产率和感染性影响巨大.研究发现膜相关泛素连接酶家族蛋白(membrane-associated RING-CH,MARCH)能够降解病毒囊膜蛋白,下调假病毒产率和感染性.讨论了囊膜蛋白胞内域赖氨酸修饰对假病毒产率影响的研究进展,以期提高囊膜蛋白表达量和加工成熟效率,促进抗病毒药物研发、抗体筛选、疫苗创制和病毒受体鉴定.

目的 探究不同光照时间条件下核黄素灭活病原体效果的影响.方法 采用含水疱性口炎病毒(VSV)血浆分4 组,分别添加核黄素浓度致终浓度为 50、100、150 μmol/L,0 μmol/L为对照组.观察其在 10、15、20、25 min的生长滴度,不进行光照的为对照组.用Reed-Muench法计算灭活前后培养后生长滴度,通过灭活后log减少因子评价不同浓度核黄素对灭活效果的影响.结果 在无光照的条件下添加核黄素无病原体灭活效果,随着光照时间从 15 min增加到25 min,无核黄素组VSV灭活效果增加;当光照小于 15 min时,50～150 μmol/L核黄素VSV灭活效果差异无统计学意义;当光照时间为15～25 min时,添加核黄素后VSV灭活效果增强,但不同浓度核黄素组间差异无统计学意义.结论 在25 min内核黄素病原体灭活效果随光照时间的增加灭活效果越好,与核黄素浓度影响较小.