目的:通过胚胎干细胞发育毒性评价模型研究Cry1Ab蛋白对于细胞增殖和分化能力的影响,以评估其发育毒性.方法:设置 Cry1Ab 蛋白 7 个剂量组(31.25、62.50、125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00 μg/L),以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)为阳性对照,以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)为溶剂对照,分别处理小鼠胚胎干细胞D3(embryonic stem cell line D3,ES-D3)和小鼠成纤维细胞3T3.通过CCK-8法检测细胞活性,计算受试物对于不同细胞的增殖半抑制浓度(50％inhibition concentration of growth and viability,IC50).设置Cry1Ab 蛋白 5 个剂量组(125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00 μg/L),设置溶剂对照(PBS),同时以 5-FU 为受试物进行模型验证,分别处理细胞后,通过拟胚胎体(embryonic bodies,EBs)培养法诱导ES-D3分化出心肌细胞;镜下观察EBs生长情况并测量其第3天和第5天的直径,观察并记录同批次EBs分化出搏动心肌细胞的比例,计算受试物的心肌分化半抑制浓度(50％inhibition concentration of differentiation,ID50),根据发育毒性判别函数对受试物的胚胎发育毒性进行分类;收集培养终点的EBs样本,进行实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative po-lymerase chain reaction,qPCR),检测心肌分化相关标志物(Oct3/4、GATA-4、Nkx2.5 和 β-MHC)的 mRNA 表达情况.结果:5-FU 的 IC50,3T3为 46.37 μg/L,IC50,ES为 32.67 μg/L,ID50,ES为 21.28 μg/L,根据判别函数结果将 5-FU 分类为强胚胎毒性物质.不同浓度的Cry1Ab蛋白处理组的3T3细胞和ES-D3细胞活性与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05).与对照组相比,Cry1Ab蛋白处理组分化第3天和第5天的EBs直径差异无统计学意义(P＞0.05),EBs形态也未见明显差异;不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的心肌分化率与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).5-FU使β-MHC、Nkx2.5和GATA-4的mRNA表达水平降低(P＜0.05),且具有剂量依赖趋势(P＜0.05),而与细胞多能性相关的标志物Oct3/4 mRNA表达水平则呈升高趋势(P＜0.05);Cry1Ab蛋白处理组的成熟心肌标志物β-MHC、心肌早期分化标志物Nkx2.5和GATA-4、多能性相关标志物Oct3/4的mRNA表达水平与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:本实验模型中未观察到31.25-2 000.00 μg/L的Cry1Ab蛋白具有发育毒性.

为明确M-49和X-37转基因棉Cry1Ab/c蛋白在主茎叶片的时空分布,采用酶联免疫法(ELISA)对主茎叶片的Cry1Ab/c蛋白含量进行检测,并利用考马斯亮蓝法检测叶片水溶性总蛋白含量.结果表明:X-37主茎叶片Cry1Ab/c蛋白整体含量高于M-49;两种转Bt棉主茎叶的Cry1Ab/c蛋白含量由顶端向底层逐渐增加,现蕾期(6月3日)和初花期(6月27日)底层叶片Cry1Ab/c蛋白含量显著高于顶端叶片;花铃期(8月6日)和铃期(8月26日)中上部叶片Cry1Ab/c蛋白含量均无明显差异.另外,在初花期(6月27日)主茎上部叶片的Cry1Ab/c蛋白与水溶性总蛋白比显著高于中下部叶片.总体上,两种转Bt棉主茎叶片Cry1Ab/c蛋白叶片含量分布由下至上逐渐减少,随生育期的推进呈先增后降,在初花期的上部叶片Cry1Ab/c蛋白与水溶总性蛋白比变化较其他生育期明显.

[目的]棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)对Bt(Bacillus thuringiensis)的抗性问题是阻碍Bt抗虫棉持续发展的关键,探究棉铃虫对不同Bt蛋白的抗性演化趋势及交互抗性,可为选择合适的抗虫棉花备选基因提供参考.[方法]在室内通过连续多代筛选,获得了5个对Bt具有不同抗性的品系,利用饲料混合法测定了这些品系棉铃虫的交互抗性.[结果]经筛选后棉铃虫对Cry1Ac产生了超高水平的抗性、对Cry2Ab、Vip3Aa产生了超低抗性(耐性);Cry1Ac抗性棉铃虫停止筛选而换成Cry2Ab或Vip3Aa继续筛选后,棉铃虫对Cry1Ac抗性水平明显降低,对Cry2Ab或Vip3Aa产生低抗或超低抗性(耐性).Cry1Ac抗性棉铃虫对Cry1Ab敏感性显著降低,而对Cry2Ab、Cry2Ah及Vip3Aa敏感性变化不显著;Cry2Ab抗性品系棉铃虫对Cry1Ac敏感性显著降低;Vip3Aa抗性品系棉铃虫对Cry1Ac敏感性变化不显著.说明Cry1Ac与Cry1Ab间存在明显交互抗性,与Cry2Ah、Vip3Aa没有交互抗性;而Cry2Ab与Cry1Ac间存在不对称的交互抗性.[结论]在筛选新杀虫基因或叠加基因时,应充分考虑抗性发展及交互抗性问题,Cry2Ah、Vip3Aa是治理Cry1Ac抗性棉铃虫或与Cry1Ac叠加最优的选择.

[目的]探讨转cry1Ab/cry2Aj和G10evo-epsps基因玉米双抗505-12-5中外源Bt蛋白时空表达规律,对3种主要鳞翅目害虫亚洲玉米螟、黏虫和棉铃虫的抗性进行鉴定,为转基因玉米双抗505-12-5的商业化推广提供科学的数据支撑.[方法]Bt蛋白时空表达规律采用酶联免疫法(ELISA),田间抗虫性和室内抗虫性鉴定分别采用田间人工接虫和离体组织生测方法.[结果]在玉米6～8叶期,Bt含量表现为根>心叶>茎,分别为517.3、453.8和312.8 ng?g-1;大喇叭口期,Bt含量表现为心叶>根>茎,分别为353.3、281.3和232.9 ng?g-1;吐丝期,Bt含量表现为心叶>根>茎,分别为188.9、114.1和53.6 ng?g-1;乳熟期,根、茎和心叶含量相当,分别为178.0、160.3和185.4 ng?g-1;繁殖器官中Bt蛋白含量表现为籽粒>花丝>花粉>雄穗,分别为181.3、100.1、95.0和79.8 ng?g-1.室内抗虫性鉴定表明,转基因玉米双抗505-12-5心叶饲喂黏虫24 h,幼虫死亡率低,但48 h后达98.21％;双抗505-12-5心叶、花丝和籽粒饲喂玉米螟,24 h幼虫死亡率分别为87.37％、100％、100％;双抗505-12-5花丝饲喂棉铃虫,24 h幼虫死亡率达80.18％,48 h死亡率为92.45％.田间鉴定结果显示,转基因玉米双抗505-12-5在心叶期和雌穗期对玉米螟、心叶期对黏虫、雌穗期对棉铃虫的抗性均达高抗水平.[结论]转基因玉米双抗505-12-5各器官在不同生育期中均能表达Bt蛋白,尤其在鳞翅目害虫为害的主要时期6～8叶期和吐丝期及乳熟期,易受害器官中Bt蛋白表达量较高.转基因玉米双抗505-12-5田间及室内对3种鳞翅目害虫均表现了显著的抗性效果,具有推广应用的潜力.

白符跳Folsomia candida和赤子爱胜蚓Eisenia fetida是土壤生态系统中的重要指示动物.本文采用酶联免疫吸附剂法 (ELISA) 测定转Cry1Ab-Ma基因抗虫玉米CM8101完熟期叶片、茎秆、根组织的Cry1Ab-Ma蛋白含量,并通过在培养基和土壤中添加转基因玉米CM8101残体分别饲养白符跳和赤子爱胜蚓,研究了转基因玉米CM8101对白符跳存活率和赤子爱胜蚓生长发育及繁殖的影响.结果表明,在叶片、茎秆、根组织中均能检测到Cry1Ab-Ma蛋白,含量介于1.06-4.66 μg/g鲜重之间;转基因玉米CM8101较之非转基因对照郑58,对白符跳的存活率,赤子爱胜蚓的存活率、体重变化量、蚓茧量和孵化幼蚓量均无显著影响,可初步推断转基因玉米CM8101在两个月内对土壤动物无安全风险.

目的:研究抗虫抗草甘膦玉米转化体ZD12-6外源基因的分子特征,对ZD12-6的抗虫和抗草甘膦性状进行综合评价,为ZD12-6产业化提供基础信息.创新点:抗虫抗草甘膦转基因玉米ZD12-6是聚合了双抗虫基因和抗草甘膦基因的转化体,多基因聚合有利于后期品种转育和多性状叠加.对该转化体的分子特征信息分析和功能评价是评判其产业化价值的重要依据.方法:利用DNA印迹法(Southern blot)研究外源基因插入拷贝数;利用高效热不对称交错聚合酶链反应(hiTAIL-PCR)方法对外源基因的插入位点进行定位;通过蛋白质印迹法(Western blot)对外源蛋白进行定性分析;利用酶联免疫吸附测定(ELISA)分析外源蛋白表达量;通过生物测定对抗虫和草甘膦的抗性水平进行评估.结论:抗虫抗草甘膦玉米转化体ZD12-6中外源基因单拷贝插入,插入位点位于玉米1号染色体.ZD12-6对玉米上的主要害虫具有良好抗性,同时对草甘膦具有较强耐受性,具有产业化推广潜力.

目的 探讨转Cry1Ab和epsps基因抗虫耐除草剂玉米对F3代大鼠免疫功能的影响.方法 180只断乳F0代SD大鼠按体重随机分为AIN-93G饲料对照组、亲本玉米组和转基因玉米组.经三代繁殖产生F3代仔鼠后,对其进行抗体生成细胞检测、刀豆蛋白(concanavalin A,ConA)诱导大鼠脾淋巴细胞转化试验、自然杀伤(natural killer,NK)细胞活性检测、全血淋巴细胞亚群检测、迟发型变态反应检测及免疫器官脏器系数等检测.结果 在抗体生成细胞数、ConA诱导的大鼠脾淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性、全血淋巴细胞亚群分类及迟发型变态反应、胸腺系数等方面,转基因玉米组与亲本玉米组相比,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 在本试验条件下,转Cry1Ab和epsps基因抗虫耐除草剂玉米饲喂SD大鼠三代后,对F3代大鼠的免疫功能未见不良影响.

[目的]探讨转基因玉米表达的3种Bt蛋白对非靶标害虫玉米蚜的影响效应,为农田生态系统中转基因玉米的环境安全评价提供依据.[方法]在玉米蚜全纯人工饲料中分别添加Bt蛋白Vip3Aa19、Cry1Ab和Cry1Ah饲养玉米蚜,并以PBS缓冲液或Na2 CO3溶液为阴性对照,添加酪蛋白(casein,CS)为中性对照,添加印楝素(neem oil)为阳性对照,比较分析Bt蛋白等各处理对玉米蚜存活率、发育历期、有翅蚜率及繁殖力的影响.[结果]低浓度印楝素(Neem-L)处理后玉米蚜半数个体生存时间(ST50)为3.2～4.0 d,高浓度印楝素(Neem-H)处理后,玉米蚜在第4天全部死亡,这2个处理均没有子代若蚜产生.添加Bt蛋白和CS对玉米蚜的生存时间没有显著影响,ST50在8.3～9.6 d之间.与阴性对照相比,3个Bt蛋白和CS处理的若蚜期显著短1.0～2.9 d,产出的下一代若蚜数显著增多.Vip3Aa19、Cry1Ab以及CS处理后,有翅蚜比例显著高于其阴性对照.[结论]饲料中分别添加3种Bt蛋白Vip3Aa19、Cry1Ab和Cry1Ah对玉米蚜的存活率没有显著影响,但具有与添加CS等同提高饲料营养质量的效果;与阴性对照相比,添加3种Bt蛋白对玉米蚜的生长发育和繁殖具有显著的促进效应.

[目的]室内抗螟性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价的重要环节.[方法]采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量;采用室内生测法测定了分别取食转基因玉米ZZM030和非转基因玉米X249心叶后亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis敏感品系ACB-BtS、Cry1Ab抗性品系ACB-AbR和Cry1Ac抗性品系ACB-AcR初孵幼虫的存活率.[结果]转基因抗虫玉米ZZM030 4叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量分别是10.62和2.94 μg/g FW.敏感品系亚洲玉米螟初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶2d的存活率仅为23.6％,4 d后存活率为0,而取食非转基因对照玉米X249心叶4d的存活率高达93.1％.Cry1Ab抗性品系和Cry1Ac抗性品系初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶6d后的存活率分别为11.1％和12.5％,而取食非转基因玉米X249心叶6d后的存活率分别为81.9％和77.8％.[结论]转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中高表达的Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白对亚洲玉米螟初孵幼虫具有极高的杀虫效果.

外源蛋白在环境中的残留与积累是转Bt基因作物环境安全评价的重要内容之一.我国已育成多个具有商业化前景的Bt稻品系,但目前多年种植Bt稻后Bt外源蛋白是否会在土壤中积累还不清楚.本研究在同一试验田连续9年种植了转cry1Ab/1Ac基因明恢63(华恢1号)和转cry2A基因明恢63水稻,采用酶联免疫吸附法(ELISA)跟踪监测了分蘖期和收获后60 d根际土中外源蛋白含量变化,试验第1年(2012年)和最后1年(2020年)还测定了苗期、开花期和成熟期根际土中外源蛋白含量.结果 表明:2012年,转cry1Ab/1Ac基因明恢63在苗期、分蘖期、开花期、成熟期和收获后60 d根际土中外源蛋白含量分别为1.25、1.77、1.97、1.71和0.30 ng·g-1,2020年分别为1.30、1.69、2.03、1.77和0.43 ng·g-1;2012年,转cry2A基因明恢63在苗期、分蘖期、开花期、成熟期和收获后60 d根际土中外源蛋白含量分别为0.91、1.52、1.53、1.37和0.12 ng· g-1,2020年分别为0.95、1.43、1.61、1.40和0.15 ng·g-1.多因素方差分析显示,时间效应对Bt外源蛋白积累不显著,而品种和生育期效应显著.Bt稻生长过程中根际土中可以检测出微量的Bt外源蛋白,但收获后60 d已经基本降解完毕,根际土中Bt外源蛋白含量不会随着种植时间的增加而累积.