目的 探讨siRNA沉默DJ-1基因体内外对人胃癌MGC803细胞的影响机制.方法 构建沉默DJ-1基因MGC803细胞;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、平板克隆、细胞划痕和侵袭实验检测沉默DJ-1基因对MGC803细胞增殖、克隆形成、迁移与侵袭的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测DJ-1、PTEN、Akt、p-Akt、Snail、Vimentin、E-cadherin、基质金属蛋白酶9(MMP-9)与基质金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP3)的表达;相差显微镜观察DJ-1沉默对MGC803细胞形态学的影响;裸鼠实验检测DJ-1沉默对MGC803细胞移植瘤的影响.结果 分别用4组si-DJ-1及si-NC质粒转染MGC803细胞,其中si-DJ-1A组DJ-1 mRNA与蛋白表达下调较为显著(P＜0.001),则后续选用si-DJ-1A作为稳定沉默DJ-1基因MGC803细胞.MTT法检测结果显示,24、48和72 h后,si-DJ-1组增殖活性分别较MGC803对照组和si-NC组降低,均P＜0.001.克隆形成实验显示,si-DJ-1组克隆形成数较对照组与si-NC组减少,P＜0.001.划痕实验结果显示,si-DJ-1组迁移距离[(199.21±14.74)μm]较对照组[(302.62±17.70)μm]和si-NC组[(304.49+13.55)μm]缩短,P＜0.001.侵袭实验显示,si-DJ-1组侵袭细胞数[(44.80±5.10)个]较对照组[(83.80±5.80)个]和 si-NC 组[(82.80±5.80)个]减少,P＜0.001.与对照组和 si-NC 组相比,si-DJ-1 组 DJ-1 mRNA(F=18.350,P=0.003)、Snail mRNA(F=26.320,P＜0.001)、Vimentin mRNA(F=44.379,P＜0.001)与 MMP-9 mRNA(F=57.450,P＜0.001)下调,而 E-cadherin mRNA(F=94.529,P＜0.001)与 TIMP3 mRNA(F=16.480,P=0.004)上调;si-DJ-1 组 DJ-1(F=6.393,P=0.004)、p-Akt(F=12.980,P=0.007)、Snail(F=381.000,P＜0.001)、Vimentin(F=99.750,P＜0.001)与 MMP-9(F=126.800,P＜0.001)蛋白下调,而 PTEN(F=36.880,P＜0.001)、E-cadherin(F=181.000,P＜0.001)与TIMP3(F=217.800,P＜0.001)上调.相差显微镜显示,si-DJ-1组纤维母细胞样长梭形细胞肿瘤干细胞减少,圆形与椭圆形细胞增多,异型性下降.体内实验表明,si-DJ-1组移植瘤生长速度较对照组减慢,si-DJ-1 组移植瘤质量[(0.51±0.05)g]较对照组[(0.90±0.16)g]减小,t=5.273,P＜0.001.si-DJ-1 组较对照组 DJ-1、Ki-67、Vimentin和CD-34阳性表达降低,而PTEN和E-cadherin表达增强.结论 DJ-1沉默可通过PTEN/Akt通路体内外抑制MGC803细胞增殖、迁移、侵袭与上皮细胞-间充质转化.

目的:采用RNA干扰技术下调DJ-1基因在肺鳞癌细胞HTB-182中的表达，采用串联亲和纯化质谱(TAP-MS)技术寻找DJ-1在HTB-182细胞系中的相互作用蛋白。方法:构建靶向DJ-1基因siRNA慢病毒载体，感染HTB-182细胞(DJ-1 siRNA组)，并设立慢病毒载体对照组(Control siRNA组)及空白对照组，采用Western blot法检测DJ-1蛋白表达水平，建立内源性的DJ-1蛋白表达沉默的si-DJ-1-HTB-182细胞。设计DJ-1的特异性引物，构建带有链霉素结合肽标签(SBP)、钙调蛋白结合肽标签(CBP)的DJ-1表达质粒pNTAP-DJ-1，用脂质体稳定转染细胞系DJ-1 siRNA HTB-182，G418筛选阳性克隆，Western blot进行验证，TAP-MS技术寻找DJ-1的相互作用蛋白。结果:DJ-1 siRNA干扰组中DJ-1的蛋白质表达明显低于空质粒(NC)组和空白对照(BC)组( P<0.05)；成功构建了稳定表达pNTAP-DJ-1质粒的HTB-182细胞系；TAP-MS筛选到DJ-1相互作用的三个蛋白质：细胞角蛋白1(Keratin 1)、细胞角蛋白10(Keratin 10)和NADPH氧化酶活化蛋白P47(P47 Px)。 结论:Keratin 1、Keratin 10和P47 Px可能是DJ-1蛋白的相互作用蛋白。

目的:探讨上调或沉默DJ-1基因表达对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞凋亡、迁移和侵袭的影响,及可能的分子作用机制.方法:分别采用免疫组织化学法、蛋白质印迹法以及实时荧光定量PCR法检测CRC组织和细胞中DJ-1 mRNA及蛋白的表达水平.将携带有DJ-1全基因的重组慢病毒载体感染SW480和HCT116细胞构建过表达(over-expression,OE)DJ-1的SW480/OE-DJ-1和HCT116/OE-DJ-1细胞,以感染空载体的细胞作为阴性对照(OE-NC);将携带特异性针对DJ-1基因的shRNA-DJ-1(shDJ-1)重组慢病毒载体感染SW480和HCT116细胞构建沉默DJ-1表达的SW480/shDJ-1和HCT116/shDJ-1细胞,以感染空载体的细胞作为阴性对照(sh-NC).再分别采用免疫组织化学法和实时荧光定量PCR法检测CRC组织中DJ-1和p53蛋白和mRNA的表达情况,并分析DJ-1与p53之间的相关性.蛋白质印迹法检测沉默或过表达DJ-1对p53及其下游凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达的影响.采用Transwell小室法检测沉默或过表达DJ-1对SW480和HCT116细胞侵袭和迁移能力的影响.用转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导CRC细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),随后采用蛋白质印迹法检测DJ-1与EMT相关标志物[N-钙黏蛋白(N-cadherin)、β-连环蛋白([β-catenin)、波形蛋白(vimentin)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)]表达的变化.结果:免疫组织化学法检测结果提示,DJ-1在34例CRC组织样本中高表达(24/34,70.59％)(P＜0.001).DJ-1高表达者的总生存期明显短于低表达者(P＜0.001),DJ-1高表达与TNM分期、肿瘤部位、是否有淋巴结转移以及分化程度均有相关性(P值均＜0.05).免疫组织化学法和实时荧光定量PCR法检测结果均提示,DJ-1与p53的表达呈负相关(r=-O.428,P=0.015).沉默DJ-1表达可上调p53及其下游凋亡蛋白Bax的表达水平,下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(P值均＜0.05),SW480和HCT116细胞的迁移及侵袭能力被降低(P值均＜0.01);反之,DJ-1过表达可下调p53和Bax的表达水平(P值均＜0.05),而上调Bcl-2的表达水平,SW480和HCT116细胞的迁移及侵袭能力被提高(P值均＜0.01).TGF-β1上调DJ-1表达后,间质细胞标志物N-cadherin、β-catenin和vimentin的表达水平上 调(P值均＜0.05),上皮细胞标志物E-cadherin的表达水平下调(P值均＜0.05).结论:DJ-1通过负向调控p53信号途径促进CRC细胞的增殖和侵袭.

DJ-1又称为PARK7,其突变与癌症或常染色体隐性遗传早发性帕金森病(PD)有关.DJ-1是一种非典型的类过氧化物酶,可作为氧化还原依赖的伴侣蛋白和转录调节因子.本研究通过GEO数据库获取GSE17204数据集的表达矩阵,该数据集通过对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y进行DJ-1沉默和基因芯片分析获得.采用基因集富集分析方法(GSEA)对该数据集进行分析从而评估DJ-1的可能功能.结果 表明:DJ-1沉默的细胞中细胞周期调控信号、mTORC1信号等受到激活、炎症及免疫信号、低氧应激等信号受到明显的抑制.mTORC1信号、低氧应激信号等已经有大量研究显示其与DJ-1功能的联系.因此,本研究基于GSEA的分析结果是可靠的,这为DJ-1功能的研究提供更多的线索.

目的 检测新鲜子宫内膜癌组织及癌旁正常组织中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化水平以及miR-128-2和DJ-1(RS/PARK7/CAP1)表达水平,并分析其相关性,拟从组织学水平寻找miR-128-2基因启动子DNA甲基化可能参与子宫内膜癌DJ-1表达调控的相关证据.方法 收集江西省妇幼保健院经手术切除的63例子宫内膜癌组织标本及其相配对的癌旁正常子宫内膜组织,采用荧光实时定量甲基化特异性PCR(qMSP)方法检测组织中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化水平、荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-128-2以及DJ-1 mRNA表达丰度、Western blot检测DJ-1蛋白表达水平,同时比较分析miR-128-2基因启动子DNA甲基化与miR-128-2、DJ-1表达与临床病理因素间的相关性.结果 与癌旁正常子宫内膜组织相比较,子宫内膜癌组织中miR-128-2启动子区DNA甲基化水平显著增加(P<0.01),同时miR-128-2表达下调而DJ-1 mRNA及蛋白表达上调(P<0.01);通过相关性分析发现子宫内膜癌组织中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化程度与miR-128-2表达负相关(Pearson相关系数r=-0.9693,P<0.01)而与DJ-1 mRNA表达正相关(Pearson相关系数r=0.8762,P<0.01).此外,通过临床病理资料发现miR-128-2甲基化水平、miR-128-2以及DJ-1 mRNA表达水平均与子宫内膜癌患者的病理类型、分化程度无关,而与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和临床分期相关(P<0.05).结论 在组织水平佐证了子宫内膜癌中DJ-1表达上调可能与miR-128-2基因启动子区高DNA甲基化及其表达沉默有关.

目的 研究DJ-1在前列腺癌(PCa)组织中的表达,结合临床病理特征,探索DJ-1与PCa的发生、发展及预后关系,并揭示DJ-1对PCa细胞增殖和侵袭能力影响.方法 选取51例PCa患者组织样本作为实验组,50例良性前列腺增生患者组织样本作为对照组.采用免疫组化(SP)法检测标本组织中DJ-1表达情况,分析DJ-1表达水平与PCa的临床和病理参数之间的相关性,并通过TCGA数据库挖掘PCa组织和癌旁组织间DJ-1的表达及甲基化修饰水平差距;培养PCa LNCaP细胞株,采用细胞增殖毒性(CCK)-8技术、平板克隆形成技术、Transwell小室实验和细胞划痕实验技术检测沉默DJ-1表达后对LNCaP细胞增殖和侵袭能力影响.结果 DJ-1在PCa中的表达水平明显高于前列腺增生(P<0.05).TCGA数据库的挖掘PCa组织的DJ-1 mRNA的表达量明显高于癌旁正常组织,而甲基化修饰水平显著低于正常组织(P<0.05).与阴性对照(NC)组和空白对照(CON)组相比,沉默(KD)组PCa细胞增殖、侵袭和迁移能力明显降低(P<0.05).结论 DJ-1在PCa组织中高表达,沉默DJ-1表达可显著降低PCa LNCaP细胞增殖、侵袭及迁移能力,DJ-1可能与PCa的发生发展密切有关.