目的 筛查广西贺州地区无偿献血者Mur血型抗原分布频率,并对Mur抗原阳性样本进一步分析其分子基础.方法 采用微孔板血型血清学方法筛查广西贺州地区无偿献血者Mur表型,分析Mur血型抗原在不同少数民族人群中分布频率.对血清学筛查结果阳性样本通过PCR-SSP方法进行基因定型,验证血清学方法的准确性,并测序分析其基因背景.结果 在 3 298 例贺州地区无偿献血者标本中筛选出Mur抗原阳性 432 例(13.10%,432/3 298),PCR-SSP基因分型验证显示 432 例标本均为电泳阳性.其中,汉族献血者Mur抗原阳性占比 12.79%(331/2 587),瑶族 13.25%(64/483),壮族 16.51%(36/218),3 组数据无统计学差异(P＞0.05).进一步的测序结果显示,其中 428 例为GYP(B-A-B)Mur,即GYP.Mur型(12.98%,428/3 298)),其余 4 例为GYP(B-A-B)Bun,即GYP.Bun型(0.12%,4/3 298).结论 广西贺州地区无偿献血人群Mur血型频率较高,且以GYP.Mur基因型为主.由于民族融合等因素,汉族与壮族、瑶族等少数民族Mur血型分布频率无显著性差异.因此,本地区广泛开展Mur血型抗原抗体检测,对于保障临床输血安全具有重要意义.

采用转录组数据挖掘与实验验证相结合的研究策略,识别表征激素性股骨头坏死(SONFH)痰、瘀、虚证素的标志基因.首先,利用项目组前期临床转录组学检测所得SONFH痰瘀阻络证、经脉痹阻证、肝肾亏虚证共性差异表达基因集,整合差异表达趋势分析与功能挖掘,分别预测出表征痰、瘀、虚证素的候选标志基因集.再利用来源于临床SONFH患者的全血样本、SONFH大鼠的全血和受累股骨头组织样本,采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测上述候选标志基因的表达量;进一步,采用受试者工作特征曲线(ROC)法,客观评价上述候选标志基因的辨证效能.转录组数据分析结果显示,痰证素候选标志基因为超长链脂肪酸延伸酶6(ELOVL6),瘀证素候选标志基因为锚蛋白1(ANK1)、血型糖蛋白A/B(GYPA/B)、Rh相关糖蛋白(RHAG),虚证素候选标志基因为溶质载体家族2(促进葡萄糖转运体)成员1(SLC2A1)、胃口素(STOM).qPCR验证结果显示,与非SONFH组比较,ELOVL6在痰瘀阻络证患者外周血中的表达量最低(P＜0.05);与正常对照组比较,其在SONFH大鼠造模4周外周血和受累股骨头组织中的表达量最低(P＜0.01),且对大鼠造模4周的辨证效能(AUC=0.850,P=0.006)优于其他造模时间点(8、12、16、21 周 AUC 分别为 0.689、0.766、0.588、0.662).与非 SONFH 组比较,ANK1、GYPA、RHAG 均在经脉痹阻证患者外周血中表达最低(P＜0.05);与正常对照组比较,其在SONFH大鼠造模12周外周血和受累股骨头组织中的表达量最低(P＜0.05,P＜0.01),且对大鼠造模 12 周的辨证效能(ANK1:AUC=0.855,P=0.006;GYPA:AUC=0.861,P=0.012;RHAG:AUC=0.854,P=0.009)优于其他造模时间点(4、8、16、21 周,ANK1 的 AUC 分别为 0.630、0.658、0.657、0.585;GYPA 的 AUC 分别为 0.646、0.573、0.691、0.617;RHAG 的 AUC 分别为 0.592、0.511、0.515、0.536).与非 SONFH 组比较,SLC2A1和STOM均在肝肾亏虚证患者外周血中表达量最低(P＜0.05);与正常对照组比较,其在SONFH大鼠造模21周外周血和受累股骨头组织中的表达量最低(P＜0.05,STOM在大鼠外周血中表达量与正常对照组间的差异无统计学意义除外),且SLC2A1对大鼠造模21周的辨证效能(AUC=0.806,P=0.009)优于其他造模时间点(4、8、12、16周AUC分别为0.520、0.580、0.741、0.774),STOM的辨证效能无意义.综上,SONFH中痰证素的标志基因为ELOVL6,瘀证素的标志基因为ANK1、GYPA和RHAG,虚证素的标志基因为SLC2A1,有助于从基因水平揭示SONFH痰、瘀、虚证素的生物学内涵.

目的:分析MNS血型相关基因GYPA、GYPB、GYPE mRNA全长序列的特征,了解MNS血型基因的多态性.方法:随机选取无偿献血者500人份离体24 h内的抗凝血各8 ml,以血型血清学方法鉴定MN、Ss、Mia血型.从500例样本中随机选取MNS与Mia血型不同组合的5例样本,使用密度梯度离心法分离外周血中的单个核细胞(PBMC)并提取总mRNA,使用逆转录试剂盒制备cDNA,采用巢式PCR(nested PCR)方法扩增目标片段,切胶回收后分别对GYPA、GYPB、GYPE mRNA全长序列进行测序,通过Oligo 6.0软件分析碱基序列.结果:血清学检测得到MN、Ss和Mia表现型,不同个体间的红细胞与抗-Mia血清反应存在凝集强度差异.检测了 5例不同表现型组合样本的GYPA4、GYPB、GYPE基因mRNA全长序列,1例样本的GYPA mRNA中exon-6完整缺失,其他4例样本的GYPA mRNA全长完整;2例样本的GYPB mRNA中exon-2完整缺失,Mia血型阴性;2例样本的GYPB mRNA全长完整,Mia血型阳性;1例样本的GYPB mRNA中exon-5存在碱基替换;5例样本的GYPE mRNA全长完整.结论:MNS血型相关基因具有明显的多态性,mRNA全长序列的检测为GYPA、GYPB、GYPE基因结构的分析与MNS血型抗原表达的深入研究奠定了基础.

目的 建立Mur基因分型的方法,同时检测西安地区无偿献血人群中Mur血型的基因频率.方法 根据Mur基因序列特异性设计引物,建立了Mur血型的基因检测方法.同时对379例西安地区无偿献血者进行GYP(B-A-B) Mur基因检测,检出的阳性样本用抗-Mur进行确认,并随机抽取20例基因检测阴性的样本,用抗-Mur检测作为对照.结果 建立的Mur基因检测方法的检测结果与血清学检测结果吻合,证明该方法具有很好的特异性.西安市无偿献血者样本379例,检出Mur阳性4例,Mur抗原在西安地区无偿献血人群中的频率为1.05％.结论 建立的Mur基因分型方法可以替代血清学的方法用于鉴定Mur血型抗原,对于了解人群分布频率,筛查和提供相合的血液,保障临床输血安全具有重要的作用.

目的 采用高分辨率熔解曲线 (HRM) 基因分型方法对MNS杂交糖蛋白GP.Mur做基因分型并验证HRM基因分型方法的可靠性.方法 收集254例献血者全血标本 (广州地区献血者104例, 澳大利亚华裔献血者150例), 利用DNA提取试剂盒抽提基因组DNA;以HRM基因分型方法对MNS杂交糖蛋白GP.Mur做基因分型;以多重连接依赖的探针扩增技术 (MLPA) 或血清学方法对GP.Mur阳性标本做确证试验, 同时采用直接测序法对HRM检出的变异曲线标本确证.结果 HRM基因分型254例标本中杂合的GP.Mur有14例, 其中11例GP.Mur阳性标本均来自广州献血者, 经MLPA基因分型方法证实其基因型为GYP*Mur/GYPB, 另外3例为澳大利亚华裔献血者标本, 血清学试验证实红细胞表型为GP.Mur.此外, HRM方法还检出了4例变异曲线标本, 测序结果显示这4例标本均在GYPB基因上携带有点突变.结论 HRM方法能准确地对GP.Mur糖蛋白做基因分型, 该方法在突变扫描方面具有极大的优势.

目的 了解Mia和Mur血型抗原的关联和差异性,研究单克隆抗-Mia特性,评估通过抗-Mia检测目前时髦的Mur血型可靠性.方法 以微量板盐水法用单克隆抗-Mia和人源抗-Mur平行筛查当地献血者红细胞上的Mia、Mur抗原,试管法复查,异常结果标本用分子生物学技术鉴定,抗-Mia用微量板法、微柱凝胶卡法、试管法确认其性能.结果 在中山市1 789名献血者中,Mia阳性114例占6.4％(114/1 789),Mur阳性112例占6.3％率(112/1 789)(P＞0.05);Mia、Mur血型抗原同时阳性112例,同时阴性1 675例,只有剩余2例异常且均为Mia+Mur-,后被确认为含有GYP.Vw基因的GP.Vw表型(红细胞Vw+ Mia+),发生率0.11％(2/1 789);发现1例罕见的GP.Mur纯合子;建立了中山地区献血者Mia和Mur同时兼有的稀有血型库;该单克隆抗-Mia为IgG性质,在盐水和抗球蛋白中均有活性,文中的抗-Mia和抗-Mur不适合于立即离心法,它们检测对应抗原的孵育时间不能少于10min.结论 中山地区献血者Mia和Mur血型抗原频率表达密切关联(≥98.2％),有条件地区开展输血前检查时,应该检测供、受者血液Mia或Mur血型;单克隆抗-Mia检测Mia血型可代替Mur血型筛查,以做到同型输注,提高输血安全性.

目的 了解湖南省RhD阴性人群红细胞血型系统抗原基因频率的分布情况,为临床用血及建立多重稀有血型库建设奠定基础.方法 抽取本中心2019年6月～2020年6月献血者中经血清学方法确认的300名RhD阴性献血者血样,采用SSP-PCR方法做RHD基因分型,对分型结果为RhD阴性RHD基因缺失型的献血者标本,采用SSP-PCR方法做红细胞MNS、Duffy、Kell、Dombrock、Diego、Kidd、Sciawnna、Colton、Lutheran和Yt血型系统抗原基因分型,并以SPSS20统计学软件其卡方检验做统计学分析.结果 RHD基因缺失型为血清学方法确认RhD阴性者的58.67％(176/300);其中MNS血型S+/s +/Mur+基因频率:GYPB*S 0.0455(8/176)、GYPB*s 0.9545(168/176)、GYP* Dane 0.0398 (7/176);Duffy血型基因频率:FY*A 0.9656(170/176),FY*B0.0341(6/176);Dombrock血型基因频率:DO*A 0.0824(14.5/176),DO*B 0.9176(161.5/176);Diego血型基因频率:DI*A0.0256(4.5/176),DI*B 0.9744(171.5/176);Kidd血型基因频率:JK*A 0.4858(85.5/176),JK*B0.5142(90.5/176);Kell血型基因频率:KP*A 0.0057(1/176),KP*B 0.9943(175/176);Lutheran血型基因频率:LU*A 0.0057(1/176),LU*B0.9943(175/176);Yt血型基因频率:YT*A 0.0028(0.5/176),YT*B 0.9972(175.5/176).Kell血型的K+/k+、Scianna和Colton血型基因型分别为KEL * 02/ KEL*02,SC*01/SC*01和CO* A/CO*B.O型、RhD阴性及其他红细胞血型系统中低频抗原组合后的期望值频率为1/100000～1/10000.结论 湖南省RhD阴性献血人群中,MNS、Duffy、Dombrock、Diego、Kidd、Kell和Lutheran血型系统基因呈多态性分布,Kell、Colton、Scianna血型基因型均为纯合子.筛选RhD阴性献血者所获取的其他红细胞血型系统资料对建立本地多重稀有血型资料库具有重要意义.

目的 分析MNS血型相关基因GYPA、GYPBmRNA剪接体多态性,探讨各种剪接体编码的GPA和GPB蛋白异构体的亚细胞定位与MNS血型抗原表达的相关机理.方法 随机选取无偿献血者10份血液,提取外周血总mRNA,反转录为cDNA后,以巢式PCR方法扩增GYPA、GYPB基因的开放阅读框并进行Sanger测序,碱基序列与GYPA(NCBI:NM_002099)、GYPB(NCBI:NM_002100.5)比对.得到的GYPA、GYPB开放阅读框的野生型及各种剪接异构体编码序列后,通过融合PCR技术分别与绿色荧光蛋白(GFP)编码基因融合并克隆后转染到HEK293细胞进行过表达,通过聚焦激光扫描显微镜监测GPA-GFP和GPB-GFP融合荧光蛋白的亚细胞定位.结果 2例标本的GYPA mRNA中缺失外显子1与外显子2,预测的GPA蛋白异构体缺失2～26位氨基酸,GYPB mRNA全长序列完整.6例标本的GYPA mRNA完整,GYPB mRNA中缺失外显子2,预测的GPB蛋白异构体缺失13～45位氨基酸,其他外显子序列完整.1例标本的GYPA mRNA完整,GYPB mRNA的外显子5中364～385位碱基被AG替换,显示氨基酸信号肽截短.其他标本的GYPmRNA全长序列完整.GP-GFP融合蛋白的荧光信号的观察结果表明,根据各RNA剪接体克隆表达的GPA、GPB糖蛋白异构体均可表现出细胞膜表面定位分布,其中的一些可变剪接导致蛋白异构体发生不同程度的细胞内弥散,影响蛋白在细胞表面分布的速度和比例,可能构成MNS抗原强弱的原因之一.结论 GYP mRNA剪接体有明显多态性特征,但GYP mRNA的部分片段缺失不影响其编码的蛋白异构体在细胞表面的定位分布,能够确保其展示MNS抗原特性.

[背景]珊瑚适应环境的能力与机体内共附生细菌有关,然而,这些细菌在珊瑚宿主适应环境变化过程中所起的作用尚不清楚.对珊瑚共附生细菌进行纯培养,探究其生物功能和生态作用,是解析珊瑚宿主环境适应机理的重要途径.[目的]研究热耐受性不同的2种造礁珊瑚共附生可培养潜在耐热细菌多样性和功能,为理解珊瑚适应环境的能力提供新的认识.[方法]从涠洲岛选取2种热耐受性差异显著的霜鹿角珊瑚(Acropora pruinosa)和丛生盔形珊瑚(Galaxea fascicularis)为研究对象,采用2216E、海水R2A和海水GYP这3种琼脂培养基,于32℃(珊瑚热耐受阈值)培养条件下对珊瑚共附生潜在耐热细菌进行分离培养,对分离菌株进行16S rRNA基因测序和序列相似性分析.选取代表菌株进行热耐受性检验,并利用平板对峙法进行抗菌活性检测.[结果]2种造礁珊瑚共附生可培养潜在耐热细菌的多样性存在显著差异.从热敏型的霜鹿角珊瑚中获得44株细菌,隶属于4个门22个属,其中弧菌属(Vibrio)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)和Tenacibaculum为优势属;从热耐受性强的丛生盔形珊瑚中获得28株细菌,隶属于3个门11个属,其中弧菌属、假交替单胞菌属和鲁杰氏菌属(Rugeria)为优势属.此外,分离菌株中有17株菌与16S rRNA基因序列相似性低于98.65％,可能代表潜在的新分类单元.细菌热耐受性试验研究中,在26-37℃温度范围内,细菌生长速率均在34℃时最大,温度高于大多数海洋细菌的最适生长温度和珊瑚白化阈值,表明分离获得的细菌具有一定的耐热性.来源于丛生盔形珊瑚的2株鲁杰氏菌对珊瑚潜在病原弧菌具有抑制作用,而来自霜鹿角珊瑚Tenacibaculum的3株细菌对弧菌的抑制作用不明显.[结论]2种造礁珊瑚共附生可培养潜在耐热细菌具有丰富的多样性,而且蕴含着不少潜在新类群.另外,条件致病菌弧菌作为优势类群,但来源于热耐受性强的珊瑚共附生细菌对其有一定的拮抗作用.因此,本研究推测珊瑚的耐热特性与体内共生细菌对致病菌的抑制作用有关.