乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状核糖核酸(cccDNA)是HBV在肝细胞内复制的起始模板,是HBV持续感染的关键因素,能直接反映机体内HBV感染状态及复制情况.HBV cccDNA检测可作为评价抗乙肝病毒药物的有效指标.HBV cccDNA是判断HBV是否感染肝外组织的客观指标之一.血清中发现HBV cccDNA为肝细胞受损的一个重要的早期标志.HBV cccDNA定性检测主要有套式聚合酶链式反应(PCR)、选择性PCR、Southern印迹杂交法等;其定量检测的方法包括实时荧光定量PCR检测法、竞争PCR检测法、入侵者检测法等.现阶段临床检测方法普遍存在一定的不足和缺陷,尚未形成统一标准的HBV cccDNA敏感度、特异度检测体系;需进一步展开深入的研究与探讨,寻求理想检测手段,为临床诊疗提供更加可靠的参考依据.血清HBV RNA的水平可能是反映患者肝细胞内cccDNA存在和转录的最好指标.

目的:了解汗衣台抗HBV有效成分及对HepG2.2.15细胞HBVcccDNA和HBVDNA的影响.方法:对汗衣台分离提取及HPLC-ESI-MS/MS测定,发现6种含量较高的有效成分:古伦宾、异古伦宾、掌叶防己碱、蝙蝠葛碱、非洲防已碱、药根碱.予各有效成分标准品不同浓度作用于2.2.15细胞,孵育9天,取上清ELISA法测定HBsAg和HBeAg含量;荧光定量PCR法检测HBVDNA;提取细胞总DNA并以PSAD醇消化后选择性荧光定量PCR法检测HBVcccDNA;后两者抑制率做相关性分析.结果:全部浓度的异古伦宾(10～ 160μ mol/L)、非洲防己碱(10 ～ 160μmol/L)、蝙蝠葛碱(0.25 ～ 10μmol/L)、药根碱(20 ～ 320μmol/L)以及40～160μmol/L浓度的古伦宾、50～ 400μmol/L掌叶防己碱对HBsAg有明显抑制作用,40～ 160μ mol/L浓度非洲防己碱、5μmol/L蝙蝠葛碱、80～320μmol/L药根碱及200～400μmoL/L的掌叶防己碱对HBeAg有明显抑制作用;全部浓度的异古伦宾、药根碱,20～160μmol/L的古伦宾、160μmol/L非洲防己碱及400μmol/L浓度掌叶防己碱、5～10μmol/L蝙蝠葛碱对HBVDNA具有抑制作用,抑制率均不高;所有有效成分在较低浓度以上对HBVcccDNA均具有抑制作用,抑制率普遍较高,呈剂量依赖性,160 μmol/L的非洲防己碱抑制率39.55％超过干扰素21.44％,200μmol/L的掌叶防己碱抑制率29.55％超过干扰素及拉米夫定24.6％;HBVDNA与HB-VcccDNA相关性比较情况复杂,趋势一致但程度差异较大.结论:汗衣台6种主要成分均具有不同程度的抗HBV作用,均可视为抗HBV的有效成分.6种有效成分不同程度抑制HBVDNA复制,对HBVcccDNA的抑制呈剂量依赖性;上清HBVDNA检测并不能完全代表细胞内HBVcccDNA情况.

目的 定量检测肝组织内HBV cccDNA、总HBV DNA及血清总HBV DNA,分析干扰素、恩替卡韦治疗对肝组织内HBV cccDNA的影响.方法 从慢性乙型肝炎抗病毒治疗研究中选择40例HBeAg阳性病例,其中24例接受恩替卡韦治疗,16例接受干扰素治疗,收集患者治疗前后血清总HBV DNA、生化学及病毒学数据,并收集治疗前后肝穿刺活检标本,定量检测肝组织内HBV cccDNA、总HBV DNA.均值比较采用t检验,目标变量与观察变量之间的相关分析采用偏相关分析.结果 肝组织内HBV cccDNA(log10拷贝/ml)在恩替卡韦组基线为5.08±1.15,治疗后为3.80±0.85;在干扰素组基线为6.84±0.93,治疗后为6.02±1.27,两组基线值比较,差异无统计学意义(P=0.050);治疗后恩替卡韦组明显低于干扰素组(P=0.004).肝组织内总HBV DNA(log10拷贝/ml)在恩替卡韦组基线为6.42±0.80,治疗后为4.83±1.08;在干扰素组基线为6.84±0.93,治疗后为6.02±1.27,两组基线值比较,差异无统计学意义(P=0.134);治疗后恩替卡韦组明显低于干扰素组(P=0.003).肝组织内HBV cccDNA下降百分率与治疗后HBeAg有显著相关性(R2=0.183).恩替卡韦及干扰素对HBV复制指数的影响差异无统计学意义(P=0.210).结论 HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者,恩替卡韦和干扰素治疗均能显著降低肝组织内HBV cccDNA含量,恩替卡韦效果更好.

目的 探讨干扰素治疗藏族慢性乙肝患者前后肝组织HBV ccc DNA、血清HBsAg、HBV-DNA及ALT的变化及联系.方法 按照2010年慢性乙肝防治指南诊断标准入组,无菌采取25例藏族慢乙肝患者全血10mL.所有患者都予以干扰素治疗48周,治疗前、治疗后12w、48w检测肝组织HBVccc DNA、血清ALT、HBVDNA、HBsAg.结果 治疗前血清HBV DNA栽量与肝组织HBV DNA及HBV cccDNA检测值均呈正相关(Pearson相关系数r分别为0.573、0.406,两者均为P＜0.05);肝组织HBV DNA与HBV cccDNA亦呈正相关(Pearson相关系数r=0.761,P＜0.05).干扰素治疗后12w后血清HBVDNA、ALT显著改善(P＜0.05),但肝组织HBV ccc DNA未见显著下降(t=0.761,P＞0.05),48w后肝组织HBVcccDNA显著下降,且同外周血HBsAg载量有相关性.结论 基线肝组织HBV ccc DNA与血清HBVDNA有相关性,干扰素治疗后两者下降并不同步,与HBsAg显著相关,HBsAg滴度变化可以反映肝组织HBVcccDNA的变化.

目的 定量检测慢性乙型肝炎患者血清乙肝病毒RNA和肝组织乙肝病毒共价闭合环状DNA (HBV cccDNA),分析两种定量指标动态变化及其相关性.方法 应用PSAD酶消化+滚环扩增+跨缺口实时荧光PCR方法,定量检测患者甲醛固定石蜡包埋肝组织HBV cccDNA(cccDNA copies/cell),用qPCR定量检测血清样本中HBV RNA的表达水平.结果 在慢性乙型肝炎免疫耐受期、免疫清除期、低复制期、HBeAg阴性期患者的血清HBV RNA水平中位数分别是1.01×108copies/mL、3.18×106 copies/mL、5.56×103 copies/mL和3.8×105 copies/mL.在慢性乙型肝炎中,患者血清RNA水平只在免疫清除期与肝组织cccDNA具有相关性(r=0.328,P=0.016),两者在免疫耐受期、低复制期、HBeAg阴性期均没有相关性(r=-0.003,P=0.995;r=-0.581,P=0.171;r=0.041,P=0.870).HBV RNA复制效率,定义为血清中乙肝病毒RNA载量与肝组织中HBV cccDNA的比值(所有的统计量都经过了对数值转换),其在急性期肝炎患者中明显地低于慢性期患者(0.37 vs.0.99,P＜0.05).在慢性乙型肝炎的免疫耐受期、e抗原阴性期HBV RNA复制效率显著高于低复制期(1.005 vs.0.66,P=0.025;0.90 vs.0.66,P=0.048),在其他几期中差异没有统计学意义.结论 在未经治疗的乙型肝炎患者中,血清HBV RNA水平可反映处于慢性乙肝免疫清除期患者肝组织内HBVcccDNA水平,但不能反映慢性乙肝免疫耐受期、低复制期和HBeAg阴性期患者肝组织内HBV cccDNA水平;急性乙肝免疫清除期患者的HBV RNA复制效率明显低于慢性期患者.

目的 探讨儿童亲属活体肝移植术后感染乙型肝炎病毒(HBV)的情况以及相关危险因素分析.方法 对2012年8月至2014年11月天津市第一中心医院150例儿童亲属活体肝移植资料进行回顾性分析,依据供者血清乙肝核心抗体(HBcAb)检测结果分为HBcAb阳性组和HBcAb阴性组,对两组儿童亲属活体受者的HBV感染情况以及临床资料进行比较分析.符合入组条件的儿童亲属活体受者共125例,包括供者血清HBcAb阳性组47例和供者血清HBcAb阴性组78例,根据肝移植术后HBV是否是新发分为新发HBV组及非新发HBV组,统计分析两组供者性别、血清HBcAb检测结果、供肝组织共价闭合环状脱氧核糖核酸(HBVcccDNA)检测结果、受者手术时间、术中失血量、术中输注红细胞量、术中输注血浆量、术中输液总量、供者年龄、供者体重、移植物重量方面的差异.结果 两组的新发HBV感染例数分别为8例和1例,差异有统计意义(P＜0.05);余临床资料差异均无统计学意义.自所有供肝组织中共检出HBVcccDNA阳性者11例,检出率为8.8％,其中供者血清HBcAb阳性组供肝组织中HBVcccDNA阳性者10例,占比21.3％,供者血清HBcAb阴性组检出1例,占比1.3％,差异有统计学意义(P＜0.05);1 1例接受HBVcccDNA阳性供肝的儿童移植术后新发HBV感染者4例,其余114例接受HBVcccDNA阴性供肝的儿童移植术后新发HBV感染者5例,差异有统计学意义(P＜0.05).新发HBV组供者血清HBcAb(+)和供肝组织HBVcccDNA(+)例数高于非新发HBV组,差异有统计学意义(P＜0.001).供者血清HBcAb(+)与供肝组织HBVcccDNA(+)两者之间具有相关性.结论 供者血清HBcAb(+)和供肝组织HBVcccDNA(+)均增加肝移植术后新发HBV风险,且供者血清HcAb(+)与供肝组织HBVcccDNA(+)具有相关性.

目的 探讨肝细胞癌(HCC)患者血清乙肝病毒e抗原(HBeAg)与肝细胞乙型肝炎病毒(HBV)cccDNA水平的相关性研究.方法 选取2015年1月至2018年1月间抚顺市传染病医院收治的接受肝癌切除术的62例原发性肝细胞癌患者.术后收集HCC患者癌组织及癌旁组织,检测HBV感染标志物、血清HBV DNA以及组织cccDNA.结果 根据HBeAg检测结果,将62例HCC患者分为A组:HBeAg(+)/HBeAb(-)14例,B 组:HBeAg(+)/HBeAb(+)10例,C 组:HBeAg(-)/HBeAb(+)38例.三组患者性别、年龄比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05);三组肿瘤最大直径、肿瘤个数比较,差异无统计学意义(P＞0.05);A组血清HBV DNA、癌旁组织HBV DNA及cccDNA水平高于C组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),A组癌旁组织cccDNA高于B组,差异有统计学意义(P＜0.05),B组癌组织HBV DNA高于C组,差异有统计学意义(P＜0.05).HCC患者血清HBeAg与癌旁组织cccDNA和HBV DNA具有相关性(P＜0.05).HCC患者血清HBeAg与癌组织cccDNA和HBV DNA无相关性(P＞0.05).血清HBV DNA仅在TNMⅠ期及Ⅲ期患者与癌旁组织cccDNA和HBV DNA具有相关性(P＜0.05).结论 血清HBeAg与癌旁组织HBV DNA和cccDNA具有相关性,且不受TNM分期影响.

目的 探讨C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)基因对肝癌HepG2.215细胞株乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响.方法 用CRP基因过表达载体、CRP基因沉默载体、CRP基因突变载体及CRP基因空载体的慢病毒转染并筛选HepG2.215细胞稳定株进行研究.分为实验组、阴性对照组和空白对照组.采用RT-qPCR检测各组CRPmRNA表达水平,Western blot检测CRP蛋白表达水平,定量PCR检测HBVcccDNA、HBVDNA表达水平,免疫荧光检测乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)表达情况,透射电镜检查观察HepG2.215细胞病毒复制情况,采用ELISA检测培养上清中HBsAg、HBeAg的表达水平,采用RT-qPCR检测HBVmRNA、HBVpgRNA的表达.结果 CRP在HepG2.215细胞中的表达高于HepG2细胞(P<0.05).CRP基因过表达组与阴性对照组相比较,HepG2.215细胞CRP蛋白和CRPmRNA、HBVcccDNA、HBVpgRNA及HBcAg表达升高,沉默CRP基因上述各项指标表达水平下降(P均<0.05);CRP基因过表达组与空白对照组相比较,HepG2.215细胞HBVmRNA、HBVDNA、HBsAg、HBeAg表达水平升高;CRP基因沉默组与空白对照组相比较,上述各项指标表达均降低(P均<0.05);CRP基因突变表达组与空白对照组相比较,HepG2.215细胞HBsAg表达水平升高(P<0.05).结论 CRP可促进肝癌HepG2.215细胞HBV的复制,并促进HBV相关抗原HBsAg、HBeAg、HBcAg的表达.CRP突变对HBsAg表达有一定促进作用.