糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病(DM)引起的严重并发症,其发病机制可能与视网膜水肿清除机制不足相关.Müller细胞上的水通道蛋白4(AQP4)和内向整流性钾通道4.1(Kir4.1)共同参与的钾离子(K+)和水的共转运,广泛参与视网膜水液代谢,进而影响视网膜水肿清除机制.在生理状态下,AQP4/Kir4.1的表达和分布平衡,呈结构和功能性耦联关系,在病理条件下,二者的表达和分布失衡,导致水分子和K+的转运功能异常,引起细胞和组织的水肿.因此,维持AQP4与Kir4.1动态平衡对维持正常的视网膜内环境具有重要的意义.本文将从AQP4与Kir4.1在Müller细胞上的分布角度探讨水液平衡在糖尿病视网膜水肿中的机制与研究进展.

目的 探究微管骨架、水通道蛋白4(AQP4)和K+通道4.1(Kir4.1)在大鼠急性脊髓损伤后的时间变化规律.方法 90只成年雌性Sprague-Dawley大鼠,随机分组为假手术组(n=30)和损伤组(n=60),损伤组设6 h、1 d、3 d、5 d、7 d,每个亚组12只大鼠.用Allen打击法制备T10打击损伤模型.损伤后各时间点各组行脊髓含水量检测、脊髓HE染色,观察急性脊髓损伤后的病理变化;行微管蛋白、AQP4和Kir4.1免疫组织化学染色和Western blotting检测,观察急性损伤后三组蛋白的表达变化及相对灰度值分析.结果 损伤组各时间点脊髓含水量均高于假手术组(P<0.05),且5 d时最高.HE染色显示,损伤后6 h,灰质主要以出血为主;损伤后1 d,灰质出血严重,神经元肿胀加重;损伤后3 d,灰质坏死面积加大,水肿现象明显;损伤后5 d、7 d,灰质坏死更加明显,水肿现象更加严重.Western blotting和免疫组织化学染色结果显示,损伤后AQP4在灰质表达逐渐增高,且5 d表达为高峰,微管蛋白和Kir4.1表达趋势基本相同,为损伤后表达逐渐下降,5 d表达最低.结论 脊髓损伤后微管蛋白表达与Kir4.1表达趋势相似,与AQP4表达趋势相反,可能共同参与水肿形成.

远端肾小管管周膜内向整流钾通道(inwardly-rectifying potassium channel,Kir)可控制细胞膜静息电位和跨膜电压,从而参与水和电解质转运的调控.Kir4.1及Kir4.1/Kir5.1异源四聚体高表达于髓袢升支粗段、远曲小管、连接小管和集合管管周膜,是调控Na+重吸收和K+分泌的重要转运蛋白.编码Kir4,1的KCNJ10功能缺失性突变可导致EAST/SeSAME综合征的发生,主要表现为:癫痫、共济失调、神经性耳聋及以盐丢失、低镁血症、低钾血症和代谢性碱中毒为主要表现的水盐代谢紊乱.而靶向敲除KCNJ16编码的Kir5.1除了引起低血钾以外,还表现为严重的高氯性代谢性酸中毒和高钙尿.另外,KCNJ10敲除抑制钠氯同向转运体在远曲小管管腔膜的表达及活动,同时,可增强连接小管和集合管上皮钠通道的表达.细胞内的pH值、多巴胺、胰岛素和胰岛素样生长因子等因素均可调控Kir4.1和Kir4.1/Kir5.1通道活动,涉及的机制包括PKC、PI3K、Src家族以及WNK-SPAK等信号转导途径.本综述对近年肾小管管周膜Kir的研究进展加以总结,重点阐述Kir4.1和Kir4.1/Kir5.1通道功能及其活性调控.

目的·构建稳定表达大电导钙激活钾通道(large conductance Ca2+-activated K+channel,MaxiK或BK)α亚基的HEK293细胞株,探讨BKα通道的排钾机制.方法· 构建带Myc标签的BKα质粒,采用脂质体转染方法将BKα质粒转染至HEK293细胞系中,用药物G418筛选阳性单克隆细胞株,分别以Western blotting和细胞免疫荧光法检测BKα蛋白表达及定位.将稳定表达BKα蛋白的HEK293细胞系培养于玻片,形成单细胞层,分别给予5 mmol/L和100 mmol/L钾离子浓度的浴液,膜片钳单通道记录BKα的离子流.内向整流性钾通道Kir4.1的野生型和突变型(G77R、G130R、C140R和R297C)分别转染稳定转染BKα的HEK293细胞后提取膜蛋白,Western blotting检测BKα的表达情况.结果·转染后的HEK293细胞中挑选表达BKα通道的细胞株,细胞免疫荧光验证了BKα通道表达及其在细胞膜上表达.在给予100 mmol/L钾离子浓度浴液的情况下,BKα的通道开放频率(NPo)快速增加.Kir4.1的野生型和突变型分别转染稳定转染BKα的HEK293细胞后提取膜蛋白,Western blotting检测发现转染Kir4.1突变体质粒的HEK293细胞的BKα表达较野生型增加(P<0.05).结论· 成功地建立了稳定表达BKα的HEK293细胞株,BKα通道可以被高钾溶液激活;BKα通道的膜表达水平与Kir4.1通道功能状态有关,可能是由于突变的Kir4.1通道导致细胞去极化,从而激活BKα.

目的 建立高效毛细管电泳法(High Performance Capillary Electrophoresis,HPCE)同时测定热毒宁注射液中阴阳离子和小分子有机酸成分的含量测定方法.方法 以弹性石英毛细管柱(50μm×60 cm,有效长度49.5 cm)为分离通道,0.25 mmol·L-1十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)-20 mmol·L-1邻苯二甲酸氢钾溶液(pH 5.8)为缓冲溶液,分离电压-12 kV,柱温为25℃,0.6 psi压力进样6 s,于232 nm波长下检测,12种阴离子及小分子有机酸10 min内能够完全分离;6 mmol·L-1α-羟基异丁酸-12 mmol·L-1咪唑(pH 4.0)为缓冲溶液,分离电压15 kV,柱温为25℃,0.6 psi压力进样8 s,于214 nm波长下检测,6种阳离子10 min内能够完全分离.结果 热毒宁注射液中阴、阳离子和小分子有机酸在测定的质量浓度范围内均具有良好的线性关系(r≥0.9900).K+、Na+、Cl-和L-苹果酸的平均回收率分别为89.1%、106.8%、120.1%、120.7%,RSD值分别为1.57%、7.19%、4.1%、2.8%.10批次热毒宁注射液中K+、Na+、Cl-和L-苹果酸的平均含量分别为387.68、3941.25、1595.33、690.58μg·mL-1.结论 该方法简单准确,具有良好的重复性和稳定性,可为热毒宁注射液质量标准的完善提供科学依据.

目的 观察木犀草素对大鼠肠系膜上动脉的舒张作用并探讨其作用机制.方法 采用离体血管环实验方法,1×10-6.1、1×10-5.6、1×10-5.1、1×10-4.6、1×10-4.1、1×10-3.6、1×10-3.1 mol·L-1木犀草素加药组为实验组,同时设立等体积累加生理盐水组为对照组.使用Myograph动态描记系统分别记录高K+、苯肾上腺素(PE)对大鼠离体血管环的收缩作用;观察不同浓度木犀草素对高K+、PE预收缩血管环的舒张作用;同时采用多种工具药干预,探讨木犀草素舒张血管作用与内皮、钾通道及钙通道的相关性.结果 木犀草素对高K+和PE预收缩的内皮完整的微动脉血管最大舒张率分别为(42.75±3.13)％和(82.64±1.80)％;其对去内皮微动脉血管环的最大舒张率为(94.52±0.76)％;在灌注压力存在的条件下,其对高K+和PE预收缩的微动脉舒张外径分别为(160.0±3.2)和(280.0±2.2)μm;当用浓度为1×10-4.6和1×10-4.1 mol·L-1的木犀草素孵育微动脉环后,PE累积添加浓度为1×10-5 mol·L-1时,PE最大收缩率降低,分别为(92.36±6.33)％和(63.76±12.79)％;实验组的上述数据与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05).结论 木犀草素对高K+和PE引起的血管收缩有浓度依赖性的舒张作用,其舒血管的机制与受体操纵性钙通道(ROCC)和电压依赖性钙通道(VDCC)有关.