目的 观察选择性神经前体细胞发育相关受控表达分子(NEDD8)活化酶(NAE)抑制剂MLN4924对人宫颈癌Hela细胞株增殖和凋亡的影响.方法 使用不同浓度MLN4924(0.5、1.0、2.0 μmol·L-1)加入Hela细胞株处理24 h,以不加MLN49240为对照组.免疫印迹法(WB)检测泛素连接酶蛋白(Cullins-1)、S期激酶相关蛋白(Skp2)、磷酸化核因子κB抑制蛋白α(P-IκBα)及p50的表达水平;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌水平.MTT比色法检测经MLN4924处理的Hela细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率.结果 MLN4924对宫颈癌Hela细胞增殖有显著的抑制作用,随着剂量的加大抑制作用更明显,且有剂量依赖性;Hela细胞Cullins-1、Skp2及p50表达下调,P-IKBα上调(P＜0.05);各处理组IL-6、TNF-α较对照组降低(P＜0.05),S期细胞百分率较对照组升高(P＜0.05),大量四倍体细胞形成,细胞生长周期受阻;细胞凋亡率也随MLN4924剂量增大而升高.结论 NAE抑制剂MLN4924对人宫颈癌Hela细胞的增殖有明显抑制作用,诱导Hela细胞周期阻滞和凋亡.

NEDD8活化酶(NAE)是Neddylation过程中的限速酶,抑制NAE的活性,能够降低泛素-蛋白酶体系统(UpS)通路的活性和相关蛋白的降解,诱导肿瘤细胞凋亡.与蛋白酶体抑制剂相比,NAE抑制剂对干扰细胞内环境稳态更有特异性.随着对NAE研究的不断深入,多种NAE抑制剂已被报道.根据这些NAE抑制剂的结构特点,可分为AMP类似物、双黄酮类脱氧鸭嘴花碱酮衍生物和金属铑络合物类等.本文介绍了类泛素化修饰Neddylation过程,其限速酶NAE与肿瘤的生理作用,并综述了NAE抑制剂的最新研究进展.

目的 观察选择性NEDD8活化酶(NAE)抑制剂MLN4924对人肝癌细胞HepG2侵袭和迁移的影响,探讨其相关机制.方法 将肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMMC-7721分别分为对照组与MLN4924干预组.细胞毒性/增殖检测试剂盒(CCK-8)方法检测细胞活性及半抑制浓度(IC50)值,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化,细胞划痕和Transwell实验检测MLN4924对细胞侵袭和迁移的影响,Western blot法检测上皮-间充质转化(EMT)中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达变化.结果 CCK-8方法发现3种肝癌细胞均受到抑制,其中HepG2对MLN4924敏感,ICso值为3.34 μmol/L.流式细胞仪测得MLN4924能够明显促进肝癌细胞HepG2凋亡,细胞划痕实验和Transwell实验证实MLN4924能够明显抑制肝癌细胞HepG2侵袭和迁移,并且具有剂量依赖性(P=0.001).此外,用0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L的MLN4924处理24h后E-cadherin相对蛋白表达量分别为0.313 ±0.005、0.594 ±0.016、0.431 ±0.002、0.780±0.019、1.000±0.015,Vimentin相对蛋白表达量分别为1.000 ±0.012、1.158±0.035、1.087±0.076、0.635±0.028、0.351±0.010.结论 MLN4924可抑制肝癌细胞HepG2的增殖,促进其凋亡,并通过EMT抑制了肝癌细胞HepG2的侵袭和迁移.

目的 探讨类泛素化修饰NEDDylation对乙型肝炎病毒(hapetitis B virus,HBV)生活史的影响.方法 利用不同浓度的NEDD8活化酶(NEDD8 activating enzyme,NAE)抑制剂MLN4924处理HepAD38细胞,阻断细胞内相关底物的活化过程,同时用HBV聚合酶抑制剂拉米夫定(lamivudine,LAM)作对照,检测HBV DNA的复制、蛋白的表达、核衣壳的形成.利用聚合酶失活的HBV表达质粒转染Huh-7细胞,然后用0.1μmol/L的MLN4924处理细胞,并用0.1％的DMSO作对照,检测核衣壳和其中的pgRNA.结果 HBV DNA复制随着MLN4924浓度增高而逐渐减弱.MLN4924浓度为0.1μmol/L时,细胞内核衣壳的量无明显变化,而其中HBV前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)下降了约47％.结论 NEDDylation参与HBV pgRNA的包装.

目的 观察NEDD8活化酶(NAE)抑制剂MLN4924对人胃癌细胞增殖和迁移的影响.方法 使用不同浓度MLN4924处理人胃癌细胞株NCI-N87和SGC-7901细胞72 h,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测抑制率.选取20％抑制浓度(IC20)浓度处理NCI-N87和SGC-7901细胞,CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖能力的变化,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化.结果 当MLN4924浓度分别达到0.528 μmol/L和0.375 μmol/L时,胃癌细胞NCI87和SGC-7901的增殖被抑制20％.CCK-8法检测结果显示,MLN4924能明显抑制胃癌细胞的增殖,且抑制作用具有剂量和时间依赖性.克隆形成实验结果表明NCI-87细胞经MLN4924作用后,克隆数低于对照组[(71.00±10.19)个比(215.33 ±9.56)个,P＜0.01].SGC-7901细胞经MLN4924作用后,克隆数低于对照组[(23.66±18.66)个比(132.33 ±34.12)个,P＜0.01].划痕实验结果显示,NCI-87细胞划痕培养48 h后,对照组细胞面积愈合率为(51.05±6.35)％,MLN4924作用后面积愈合率为(5.30±0.78)％.SGC-7901细胞划痕培养48 h后,对照组细胞面积愈合率为(23.05±2.01)％,MLN4924作用后面积愈合率为(3.12±0.52)％.结论 类泛素化修饰抑制剂MLN4924可抑制人胃癌细胞的增殖和迁移.

目的 索拉非尼是美国FDA于2007年批准的治疗肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的一线小分子抑制剂.然而,其在HCC患者中的反应率不高.本研究旨在进一步了解索拉非尼在HCC治疗中的作用机理,为HCC靶向治疗方法的优化提供理论基础.方法 使用蛋白印迹方法检测经索拉非尼治疗前后HCC细胞中与neddylation修饰相关蛋白的表达水平.通过CCK实验检测HCC细胞的增殖速率.结果 本研究发现索拉非尼能激活neddylation修饰相关的蛋白的表达.神经前体细胞表达的发育性下调蛋白8(neuronal precursor cell-expressed developmentally down-regulated protein 8,NEDD8)激活酶抑制剂MLN4924通过抑制neddylation修饰来抑制索拉非尼耐药细胞的增殖.结论 索拉非尼能引起neddylation通路的活化.泛素激活酶NAE抑制剂可以进一步抑制对索拉非尼耐药的HCC细胞的增殖.

目的 采用骨架跃迁策略设计非核苷类NEDD8活化酶(NAE)抑制剂,并测试其抗肿瘤活性.方法 通过23步反应以较高收率合成双磺酰胺类化合物14,通过1H NMR和MS确证其化学结构,采用MTT法测试体外抗肿瘤活性.结果 化合物14对多种肿瘤细胞株显示出较好的活性,并呈剂量依赖性引起UBC12蛋白累积.结论 化合物14是全新骨架的NAE抑制剂,在前列腺肿瘤细胞PANC-1中能显著引起细胞凋亡和细胞周期阻滞,为后续NAE抑制剂研究提供了一个有价值的先导化合物.

急性髓细胞性白血病(AML)是一种危及生命的血液系统恶性疾病.近年来,随着治疗方案的改进,患者预后有所改善,但仍难以解决高危患者预后差的问题.针对AML特定基因或白血病细胞表面靶抗原的靶向治疗是克服耐药性并改善AML预后的新希望.近年来,用于治疗AML的新型靶向药物数量空前增长,包括B细胞淋巴瘤/白血病-2抑制剂、FMS样酪氨酸激酶3抑制剂、异柠檬酸脱氢酶抑制剂、肿瘤蛋白p53功能激活剂、SMO蛋白抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶9抑制剂、NEDD8活化酶抑制剂、CXC趋化因子受体4拮抗剂、抗体偶联药物、免疫检查点抑制剂、双功能抗体、嵌合型抗原受体T细胞技术等,一定程度上改善了AML患者的预后.本文旨在总结AML靶向治疗的新进展.

背景与目的:类泛素化neddylation修饰在乳腺癌中的作用鲜有报道.该研究的前期研究发现,抑制neddylation修饰可诱导乳腺癌细胞发生衰老,但具体机制尚未完全阐明.研究报道核纤层蛋白lamin B1缺失可导致细胞衰老.本研究旨在探讨在乳腺癌中,neddylation修饰与lamin B1是否存在相关性及其可能的机制.方法:利用113例乳腺癌患者肿瘤组织制成的组织芯片对neddylation修饰过程中关键蛋白神经前体细胞表达发育下调蛋白8(neural precursor cell expressed developmentally downregulated protein 8,NEDD8)、NEDD8活化酶E1(NEDD8-activating enzyme 1,NAE1)及核纤层蛋白lamin B1进行免疫组织化学染色.采用Spearman rank分析NEDD8和NAE1与lamin B1表达的相关性.采用CRISPR/Cas9技术敲低NEDD8的表达以阻断neddylation修饰,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测neddylation修饰对Lamin B1表达的调控作用及其机制.结果:Lamin B1表达与NEDD8(r=0.817,P<0.0001)和NAE1(r=0.406,P<0.0001)表达呈显著正相关.敲低NEDD8以阻断neddylation修饰可显著抑制Lamin B1的表达.沉默P53表达可部分逆转阻断neddylation修饰对lamin B1表达的抑制.结论:Neddylation修饰与lamin B1表达呈正相关,靶向neddylation修饰可能通过P53依赖的方式抑制lamin B1的表达.这为乳腺癌的治疗提供了新的靶点和方向.

蛋白质拟素化是一种类似于泛素化的翻译后修饰,由NEDD8活化酶E1(NAE)、NEDD8耦联酶E2(UBE2M或UBE2F)和NEDD8连接酶E3三种酶催化组成的级联反应.Cullin家族蛋白是拟素化修饰的生理性底物,Cullin的拟素化修饰激活Cullin-RING连接酶(CRLs),CRLs是最大一类E3泛素连接酶家族,介导了其中约20％蛋白质的泛素化降解来调节许多生物过程,包括细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞生长、代谢、存活、自噬、迁移和免疫逃逸等.去拟素化过程则是通过特异性的去拟素化酶将拟素分子NEDD8从底物蛋白上水解并移除,释放至细胞中以维持拟素化的动态平衡.NEDD8和拟素化修饰的催化酶在多种癌症中高表达或活性上调,导致CRLs的过度激活,催化许多抑癌蛋白质的降解,从而促进肺癌细胞的增殖与存活以及肺肿瘤的发生发展.蛋白质拟素化修饰已被证实是有希望的癌症靶点.同样地,多种去拟素化酶在肺癌中高表达,其改变也与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关,亦是潜在的肿瘤治疗重要靶点.本综述主要聚焦于拟素化及去拟素化通路在肺癌细胞中表达水平的改变,如何调节肺癌细胞的生长、存活和肺癌微环境和炎症免疫反应以及在肺癌发生发展中的作用.了解驱动癌症发生、发展和转移的关键分子机制,提出通过靶向拟素化和去拟素化修饰各重要组件来作为肺癌治疗手段,为临床肺癌的治疗提供新的思路.