蛋白类泛素化修饰Neddylation是一种重要的蛋白质翻译后修饰。Neddylation修饰在结直肠癌中过度活化，并且与结直肠癌患者的预后不良密切相关。小分子抑制剂MLN4924通过阻断Neddylation修饰通路诱导结直肠癌细胞凋亡、自噬、DNA损伤及细胞衰老发挥抗肿瘤效应。此外，MLN4924还可作为化学增敏剂和放射增敏剂提高结直肠癌的治疗效果。本文对Neddylation修饰及MLN4924在结直肠癌中的作用机制作一综述。

Neddylation修饰通路在肺癌中过度活化，可通过激活其底物CRL泛素连接酶活性诱导CRL抑癌蛋白底物降解，从而促进肺癌的发生发展。Neddylation修饰通路的小分子抑制剂MLN4924可以诱导肺癌细胞发生细胞周期阻滞、细胞凋亡和衰老，发挥抗肺癌作用。此外，通过靶向Neddylation修饰通路关键酶及其底物Cullin家族蛋白也可以抑制肺癌发生发展。

蛋白质类泛素化修饰Neddylation是重要的新型蛋白质翻译后修饰方式，可广泛调控细胞周期、细胞生长和发育代谢等生物学过程。近年来研究发现，Neddylation修饰小分子抑制剂MLN4924具有显著的抗肿瘤效果，可通过诱导细胞周期阻滞、衰老和凋亡，以及抑制血管生成等方式抑制肿瘤生长。文章针对Neddylation修饰通路抑制剂MLN4924诱导细胞程序性死亡的相关机制研究进行综述。

目的:探讨MLN4924抑制乳腺癌细胞增殖的作用及其机制。方法:以人乳腺癌细胞MCF-7为模型细胞，采用细胞毒性和细胞的克隆形成实验探讨MLN4924对MCF-7细胞增殖的抑制作用。细胞实验分组：对照组，MLN4924浓度分别为0.1、0.3和1.0 μmol/L的实验组。动物实验分组：对照组，给MLN4924药物2.5、5.0及10.0 mg/kg的实验组。通过蛋白质印迹法(Western blot)和免疫荧光考察MLN4924对neddylation修饰的抑制作用、细胞凋亡和DNA损伤。采用GraphPad Prism 8进行统计学分析，通过 t检验评价两组数据之间的差异。 结果:MLN4924显著抑制MCF-7细胞的增殖能力，实验组的细胞集落数量显著少于对照组，可有效抑制cullin-1蛋白的neddylation修饰，实验组NEDD8的表达显著低于对照组(相对灰度值0.42±0.16比1.13±0.22， t＝8.03， P<0.01)，差异有统计学意义，诱导细胞DNA损伤，实验组γ-H2AX的表达显著高于对照组(相对灰度值0.16±0.03比0.04±0.01， t＝9.15， P<0.01)，差异有统计学意义，显著上调cleaved Caspase-3的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，在体内可有效抑制MCF-7裸鼠移植瘤的增殖，并表现出较低的不良反应。 结论:靶向neddylation能显著抑制乳腺癌细胞的增殖。

类泛素化Neddylation修饰是一种新型蛋白质翻译后修饰方式，其在消化系统肿瘤中过度活化，是潜在的抗肿瘤分子靶标。靶向Neddylation修饰通路通过诱导消化系统肿瘤细胞发生细胞周期阻滞、细胞凋亡、细胞衰老和自噬，以及增强消化系统肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性，继而发挥抗肿瘤作用。靶向Neddylation修饰通路及通路抑制剂MLN4924可作用于抗消化系统肿瘤的潜在靶点。

目的 探究 SCFβ-TrCP泛素化降解转录因子激活增强子结合蛋白 4(transcription factor-activated enhancer-binding protein 4,TFAP4)对结直肠癌上皮间质转化的影响.方法 体外培养人结肠腺癌细胞 SW480,分别用不同浓度的 MLN4924 处理24h,然后采用 Western blot法检测内源性 TFAP4 蛋白水平变化.在 MLN4924 处理的基础上,加入 CHX分别干预不同时间,检测TFAP4 的蛋白半衰期和泛素化水平差异.在 CHX 干预的 SW480 细胞中过表达带 FLAG 标签的 TrCP-1,探究 β-TrCP 对TFAP4 表达的影响,通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)实验检测过表达或敲低 β-TrCP 不是因为影响了其他信号通路而改变TFAP4 的水平.将TFAP4 上 135 位的E突变为A,139 位的S突变为A,然后在CHX干预的SW480 细胞中转染结构域突变的 TFAP4,测定 TFAP4 半衰期和泛素化水平变化.CK1/CK2/GSK3 磷酸化关键酶抑制剂对 SW480 细胞进行干预,Western blot法检测TFAP4 水平,随后检测CK2 抑制剂对TFAP4 泛素化水平的影响,通过划痕实验分析细胞迁移能力,通过Tran-swell实验分析细胞侵袭能力.结果 TFAP4 随着 MLN4924 处理浓度变化呈剂量依赖式增加,MLN4924 处理能够显著延长内源TFAP4 蛋白的半衰期,TFAP4 和 CK2 存在相互作用,CK2 抑制剂能降低 TFAP4 泛素化水平,蛋白的半衰期得到明显延长,敲低β-TrCP引起 TFAP4 的降解受到明显抑制,β-TrCP与 TFAP4 直接相互作用,并促进其被泛素化,TFAP4 中 E135A 和 S139A 位点突变延长其半衰期,沉默 β-TrCP能促进细胞增殖和迁移.结论 SCFβ-TrCP可能通过泛素化修饰降解 TFAP4,从而抑制结直肠上皮间质转化的发生,进而抑制肿瘤的浸润、转移,可为结直肠癌治疗提供新的思路.

目的 探究PKM2 拟素化(neddylation)修饰对肺动脉高压大鼠右心室纤维化的影响.方法 将SD大鼠随机分为对照组、模型组和MLN4924 组,HE染色法检测肺动脉,Masson染色检测右心室纤维化程度.提取大鼠原代心脏成纤维细胞,免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,使用si-NC、si-PKM2、pcDNA3.1-PKM2 转染原代心脏成纤维细胞后,蛋白质免疫印迹法检测PKM2 及纤维化相关Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(Collagen Ⅲ)、基质金属蛋白酶 2(MMP2)、基质金属蛋白酶 9(MMP9)等蛋白水平.蛋白质免疫共沉淀法检测PKM2 neddylation修饰.实时荧光定量PCR法检测大鼠心脏组织中PKM2 的mRNA表达水平.蛋白质免疫印迹法检测PKM2 蛋白质降解时间.结果 HE染色结果显示,模型组肺小动脉(纤维层)和内膜(内转运蛋白)之间的距离显著加宽,中间层的厚度增加,Masson染色显示,与对照组相比,模型组显示更多的胶原沉积,纤维化更严重的.模型组的PKM2 蛋白表达水平高于对照组,而mRNA水平无显著性差异.PKM2 在大鼠肺动脉高压模型中右心室组织存在neddylation修饰.在心脏成纤维细胞中敲低Nedd8 或用MLN4924 抑制neddylation修饰可下调PKM2 及纤维化相关蛋白Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP2、MMP9 等蛋白水平,促进 PKM2 蛋白质降解速率[(3.03±0.23)～(11.97±0.66)h,t =-12.82,P<0.001,过表达Nedd8 则提高PKM2 蛋白表达.MLN4924 组大鼠右心室纤维化程度及α-SMA蛋白表达水平低于模型组.结论 在肺动脉高压大鼠模型中,neddylation修饰增强了PKM2 的蛋白质稳定性进而促进右心室纤维化过程.

目的 观察选择性神经前体细胞发育相关受控表达分子(NEDD8)活化酶(NAE)抑制剂MLN4924对人宫颈癌Hela细胞株增殖和凋亡的影响.方法 使用不同浓度MLN4924(0.5、1.0、2.0 μmol·L-1)加入Hela细胞株处理24 h,以不加MLN49240为对照组.免疫印迹法(WB)检测泛素连接酶蛋白(Cullins-1)、S期激酶相关蛋白(Skp2)、磷酸化核因子κB抑制蛋白α(P-IκBα)及p50的表达水平;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌水平.MTT比色法检测经MLN4924处理的Hela细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率.结果 MLN4924对宫颈癌Hela细胞增殖有显著的抑制作用,随着剂量的加大抑制作用更明显,且有剂量依赖性;Hela细胞Cullins-1、Skp2及p50表达下调,P-IKBα上调(P＜0.05);各处理组IL-6、TNF-α较对照组降低(P＜0.05),S期细胞百分率较对照组升高(P＜0.05),大量四倍体细胞形成,细胞生长周期受阻;细胞凋亡率也随MLN4924剂量增大而升高.结论 NAE抑制剂MLN4924对人宫颈癌Hela细胞的增殖有明显抑制作用,诱导Hela细胞周期阻滞和凋亡.

目的:探讨神经前体细胞发育相关受控表达分子8(NEDD8)共价修饰抑制因子MLN4924对人卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响,并分析其可能机制.方法:使用不同浓度 MLN4924(0、0.125、0.25、0.5 μmol/L)处理人卵巢癌细胞株SKOV34 h,免疫印迹法检测PAR3、HER2、Neddylated-cullins、P-IκBα的表达水平;同时取细胞培养上清用ELISA检测IL-6的分泌.不同浓度MLN4924处理SKOV3细胞72 h,CCK8法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率.结果:MLN4924作用4 h时,能够使Neddylated-cullins下降、P-IκBα积聚,IL-6分泌减少,而PAR3、HER2表达水平变化不显著.MLN4924在0.125、0.25和0.5 μmol/L的浓度下处理SKOV3细胞72 h时,对细胞增殖有明显的抑制作用,并且随着剂量的加大,抑制效果也显著提高;同时加药组S期细胞百分率相较于对照组明显升高,且形成大量四倍体,使之没有完整的细胞周期;细胞凋亡率也随MLN4924剂量增大而升高.结论:NEDD8修饰特异性抑制剂 MLN4924能够明显抑制人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖,诱导细胞周期阻滞和凋亡.上述效应可能与NF-κB通路活性受到抑制和IL-6表达下降有关.

蛋白质的Neddylation修饰异常与多种肿瘤的发生发展密切相关.研究表明,参与Neddylation修饰的酶在肿瘤中的水平高于正常邻近组织,因此Neddylation修饰与肿瘤的关系受到高度关注.目前Neddylation修饰已成为一种新的抗肿瘤治疗靶标.全球首创的蛋白质Neddylation修饰的小分子抑制剂MLN4924可诱导肿瘤细胞发生细胞周期阻滞、凋亡、衰老以及自噬,并通过抑制新生血管生成和调节免疫细胞活性等机制发挥显著抗肿瘤作用.本文就蛋白质Neddylation修饰和其参与肿瘤细胞周期、凋亡、衰老、自噬、血管生成及免疫细胞调节的最新进展进行综述,为研发靶向Neddylation修饰的抗肿瘤药物提供理论参考.