目的 建立一种小鼠卵巢雌性生殖干细胞(FGSCs)体内分化鉴定方法. 方法 从6周龄C57BL/6小鼠卵巢利用Fragilis抗体基于免疫磁珠分选(MACS)分离FGSCs细胞,并置于STO饲养层细胞上扩增培养,采用RT-PCR法检测生殖干性基因包括Fragilis、MVH、Prdm1和Tert,细胞免疫荧光法检测Fragilis和MVH蛋白表达,利用绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体荧光标记FGSCs后将其植入受体鼠卵巢,在体内环境下促其分化发育为卵母细胞,至少12d后取卵巢置于载玻片上并压上盖玻片,直接置于荧光显微镜下观察. 结果 RT PCR结果显示FGSCs生殖干性基因包括Fragilis、MVH、Prdm1和Tert为阳性表达,而卵母细胞特异表达基因中Nobox为阴性,GDF9和ZP3为弱阳性;细胞免疫荧光结果显示FGSCs的MVH和Fragilis蛋白表达阳性,而且呈明显的膜表达.GFP-FGSCs植入6周龄雌性C57BL/6的卵巢中,至少12d以后将卵巢取出,压片后置于荧光显微镜下观测,结果显示有荧光阳性的卵母细胞. 结论 该鉴定方法简单直观,可作为FGSCs体内分化鉴定的可选方法.

目的:研究小鼠同种异体骨髓来源间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在环磷酰胺诱导的小鼠卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)损伤中的修复作用及其机制.方法:分离培养小鼠BMSCs,应用流式细胞术检测BMSCs表面标志;小鼠腹腔注射50mg/(kg.d)环磷酰胺,连续15d,建立POF模型.建模后第7天,按每只小鼠2×106个BMSCs尾静脉注射移植到POF模型小鼠体内;移植后第7天,采用HE染色观察细胞移植治疗后小鼠卵巢结构变化,RT-PCR检测BMSCs移植对POF小鼠卵泡发育相关基因mRNA表达的影响.结果:BMSCs高表达间充质干细胞标志CD29和CD90,低表达内皮细胞标志标志CD31和造血干/祖细胞标志CD34.POF模型小鼠各级发育卵泡数量明显减少,闭锁卵泡数量明显增加(P＜0.05),颗粒细胞凋亡降解.与对照组比较,BMSCs移植组小鼠卵巢窦状卵泡和次级卵泡数量明显增加,闭锁卵泡数量明显减少(P＜0.05),颗粒细胞数量明显增加,但原始卵泡和初级卵泡数量两组间差异无统计学意义(P＞0.05);BMSCs移植组卵巢组织卵泡发育相关基因Nan03,Nobox,Lhx8 mRNA水平明显高于对照组(P＜0.05).结论:BMSCs能促进POF小鼠卵泡发育和卵巢组织结构恢复.

目的:利用基因表达谱芯片筛选转移性卵巢癌相关性基因,对卵巢癌转移过程中可能参与的基因间的信号转导通路进行分析.方法:选取6例不同病理类型的转移性卵巢癌组织和2例正常卵巢上皮组织,提取DNA.采用CytoScan HD芯片检测,筛选卵巢癌转移性相关性基因,并进行基因本体(GO)和信号通路分析,筛选出对转移过程可能具有重要作用的基因.结果:染色体定位分析6例转移性卵巢癌组织共同有216个基因发生微结构异常,分别位于8、12、16、17及X染色体,其中X染色体最多.对216个基因GO分析显示,92个基因编码与3个GO分类(生物学过程、分子功能、细胞组分)相关的蛋白,信号通路分析得到20个基因具有显著性的调节信号通路.进一步与正常卵巢上皮组织对比筛选出38个差异性基因,GO分析显示24个基因编码与3个GO分类相关的蛋白,B2M和CTDSPL、NOBOX等11个基因具有显著性的调节信号通路.结论:卵巢癌的转移与多个基因相关,8、12、17号染色体拷贝数的变异可能与卵巢癌的转移密切相关,差异性基因中B2 M基因是卵巢癌转移的关键基因,通过TGF信号通路调节卵巢转移癌的转移,是一个转移性卵巢癌治疗的新靶点.

目的 NOBOX是在原始卵泡激活过程中起关键作用的转录因子,可直接调控Gdf9转录,并参与GDF9/SMAD通路影响颗粒细胞增殖分化,但其在初级卵泡及之后的具体调控机制并不清楚.Kit作为影响卵泡发育的重要基因,其启动子存在多个NOBOX结合位点.本研究拟探索在初级卵泡发育阶段,转录因子NOBOX对Kit的转录调控作用,以及通过GDF9/SMAD通路对卵泡发育的影响.方法 体外培养初级卵泡统计发育时间;qRT-PCR检测显微注射Nobox-siRNA的初级卵泡中Nobox、Kit、Kitl、Gdf9的mRNA表达变化;Western blot检测显微注射Nobox-siRNA的初级卵泡中NOBOX、KIT、P-SMAD的蛋白表达变化;ChIP实验验证转录因子NOBOX在Kit基因启动子上的结合位点.结果 初级卵泡在体外培养第5天可发育为次级卵泡,注射Nobox-siRNA的初级卵泡延缓2 d发育至次级;初级卵泡中注射Nobox-siRNA后,卵泡中Nobox、Kit、Kitl、Gdf9 mRNA表达显著下调,NOBOX、KIT、P-SMAD2/3蛋白表达量降低;转录因子NOBOX可以结合于Kit基因启动子.结论 NOBOX是小鼠初级卵泡发育至次级卵泡的关键基因,NOBOX可直接结合Kit基因启动子,且影响初级卵泡中KITL/KIT和GDF9/SMAD通路.