目的:通过对三个非复制型痘苗病毒修饰株的细胞生物学特性及小鼠体内毒力对比研究，为天花/猴痘疫苗替代产品的研制提供参考依据。方法:在BHK-21/CEF中对复制型痘苗病毒天坛株(Vaccinia virus Tiantan strain，VTT)和复制缺陷型痘苗天坛株(non-replicating Tiantan Vaccinia virus strain, NTV)及其修饰株NTV-C7L、NTV-△F1L-C7L、NTV-K1L进行扩增纯化及Western blot鉴定后，采用免疫噬斑实验对各病毒株在细胞中的毒力和扩散能力进行评价；通过复制动力学曲线比较各毒株之间的复制差异，采用小鼠滴鼻实验进行体重变化观察，比较病毒的毒力水平。结果:Western blot结果证明扩增纯化的痘苗病毒各毒株均正确。免疫噬斑及复制动力学曲线表明三株NTV基因修饰株在CEF中的复制能力与NTV相近；在Vero细胞间的扩散能力和复制能力均有所提高，但复制倍数都小于100倍；在MRC-5中复制水平与NTV相比得到明显增强，其中NTV-C7L的复制倍数达20 000倍以上；小鼠体内毒力结果显示三个NTV基因修饰株与NTV相比体重变化无统计学意义。结论:三个NTV基因修饰株在人源性细胞MRC-5中恢复了复制能力，但在小鼠中的毒力与NTV相近，具备了作为天花/猴痘疫苗换代产品候选株的初步条件。

目的:对我国非复制型痘苗病毒NTV进行基因改造，以提高其免疫原性。方法:通过基于CRISPR-Cas9技术的痘苗病毒同源重组方法，在痘苗病毒F1L基因缺失的同时回插C7L基因，构建NTV修饰株NTV-ΔF1L-C7L。然后将该重组病毒以10 7 PFU免疫BALB/c小鼠，采用ELISA和ELISpot方法分别检测修饰株NTV-ΔF1L-C7L诱导产生的体液免疫和细胞免疫水平，并采用噬斑减少中和实验测定中和抗体水平。 结果:经PCR和western blot鉴定证明构建的NTV修饰株NTV-ΔF1L-C7L的F1L基因缺失，同时C7L基因回插在该区域，且C7L基因能正常表达，说明重组病毒构建正确。NTV-ΔF1L-C7L免疫小鼠后，ELISA结果表明重组病毒NTV-ΔF1L-C7L诱导产生的IgG抗体水平高于NTV；ELISpot结果亦能够表明该重组病毒能够诱导产生水平更高的IFN-γ；噬斑减少中和实验结果表明，该重组病毒比NTV能够诱导产生水平更高的中和抗体。结论:正确构建了NTV基因修饰株NTV-ΔF1L-C7L，相比于NTV，其能诱导更强的体液免疫和细胞免疫，为我国天花或猴痘疫苗的换代产品研发提供参考数据。

目的:应用新一代长读长测序技术精准确定复制缺陷型痘苗病毒天坛株(non-replicating Tiantan strain of vaccinia virus，NTV)全基因组序列及其开放阅读框(ORFs)组成。方法:基于本实验室储备的NTV，在鸡胚成纤维细胞上进行扩增并纯化，提取NTV全长基因组核酸。PacBio HiFi测序从头组装获取NTV全长基因组序列。以同源注释的策略确定其ORF组成，并分析其与已知复制缺陷型痘苗病毒毒株ORF异同。结果:NTV全长共171 729 bp，GC含量为33%，其独特的倒置末端重复(ITR)区域包含发夹结构、两个串联重复区域及3个非重复区域。NTV共有166个ORFs，与第三代天花病毒疫苗改良安卡拉株(MVA-BN)和复制缺陷型哥本哈根株(NYVAC)株相比，主要差异位于ITR及其周围区域，3个毒株共同享有138个ORFs，NTV特有6个编码与病毒逃避宿主抗病毒反应相关的ORFs。结论:通过三代测序技术精准确定NTV全基因组序列及ORFs组成，并揭示其与其他复制缺陷型痘苗病毒毒株的异同，为新一代猴痘疫苗和痘苗病毒载体研发应用提供重要参考。

目的:对非复制型痘苗病毒NTV感染人源细胞后的细胞形态变化及相关分子机制进行研究，为NTV载体的进一步优化改造和应用提供科学依据。方法:用复制型痘苗病毒天坛株VTT和非复制型痘苗病毒NTV感染HeLa细胞，观察细胞的形态学变化。然后收获细胞，电泳检测rRNA断裂水平和Western blot检测凋亡相关分子信号，初步确定NTV诱导的早期细胞凋亡的通路与机制。结果:在细胞形态学方面观察到被NTV感染的细胞，与VTT相比，能够在较早时间出现细胞变圆、皱缩等病变现象。DAPI染色观察到被NTV感染的细胞核在早期会出现染色质高度凝聚、边缘化的现象并随着时间的增加而崩解。rRNA断裂水平检测结果说明被NTV感染16 h后的rRNA已发生断裂和降解。Western blot检测结果说明在NTV感染HeLa细胞中能够检测到比正常细胞中更强的PARP、caspase-3及caspasee-9的分子信号，但caspasee-8并没有明显增加，而VTT的结果则与NTV相反。结论:NTV在早期能够诱导细胞凋亡，为痘苗病毒载体改造提供理论依据。

目的 分析1.5T动态增强磁共振成像(DCE-MRI)参数对乳腺癌患者不良预后的预测价值.方法 选择2013年2月至2016年11月140例经病理证实的乳腺癌患者,包括82例浸润性导管癌,20例浸润性小叶癌,12例粘液腺癌,4例髓样癌,20例单纯癌,2例多形性癌.回顾性分析MRI多参数与血管病变的微血管密度(MVD)计数及胞浆血管内皮生长因子(VEGF)的相关性.结果 MRI参数:时间-信号强度曲线(TIC type)、达峰时间(Tpeak)以及MIP图血管计数(NTV)与乳腺癌的MVD及VEGF呈正相关,差异有统计学意义(P<0.05);参数:早期增强率(EER)、最大线性斜率(Slope)以及最大强化率(SImax)与乳腺癌的MVD及VEGF的相关性不明显,差异无统计学意义(P>0.05).结论1.5T DCE-MRI参数能较为准确地反映肿瘤血管病变严重性和不良预后,对于临床治疗和疗效观察具有指导意义.

目的 检测痘苗病毒早期、晚期蛋白表达水平,对复制缺陷型痘苗病毒天坛株(NTV)复制缺陷机制进行初步探究.方法 构建原核表达载体表达并纯化与痘苗病毒复制密切相关的早蛋白E3和晚期蛋白F17,免疫小鼠制备相应鼠多抗血清,用其对NTV病毒在非允许细胞中相应蛋白的表达水平进行检测.结果 在大肠埃希菌中分别表达、纯化了痘苗病毒E3和F17蛋白,并制备获得了相应的鼠多抗血清;Western blot鉴定在非允许细胞Hela中复制缺陷型痘苗病毒NTV的早期蛋白E3及晚期蛋白A27能正常表达,但晚期蛋白F17表达受到明显抑制.结论 F17蛋白表达受限可能是NTV复制缺陷的机制之一.

目的:探讨动态增强磁共振成像(DCE-MRI)各参数与人乳房珠蛋白(hMAM)、Ki67表达的关系及其临床诊断价值.方法:选取我院收治的80例女性乳腺疾病患者作为研究对象,采用DCE-MRI对患者进行扫描检查,检测病灶组织中hMAM及Ki-67水平,分析DCE-MRI各参数与hMAM、Ki67表达的关系及其临床诊断价值.结果:良性病变组病灶组织hMAM及Ki-67阳性表达量显著低于恶性肿瘤组(P＜0.05),患者早期增强率(EER)、最大线性斜率(Slope)、MIP图血管计数(NTV)水平显著低于恶性肿瘤组(P＜0.05),强化峰值(SImax)、达峰时间(Tpeak)及表观弥散系数(ADC)水平显著高于恶性肿瘤组(P＜0.05);EER、Tpeak、NTV及ADC与组织hMAM及Ki-67水平显著相关(P＜0.05);DCE-MRI诊断特异度为92.31％,诊断准确率为87.50％.结论:乳腺癌患者DCE-MRI扫描各参数与hMAM、Ki67表达水平密切相关,且具有较高的临床诊断价值.

痘苗病毒减毒株作为基因表达载体,广泛应用于多种疾病的预防和治疗.复制缺陷型痘苗病毒天坛株(Nonreplicating Tiantan vaccinia virus,NTV)作为一株高度减毒的痘苗病毒株,其生物学特性和复制缺陷机制还有待研究.探究NTV细胞生物学特性和复制缺陷机制.在不同种属和组织来源的细胞中测定NTV复制能力、细胞嗜性和毒力;Western Blot检测HeLa细胞中的NTV的A17/A27蛋白表达水平,Real-time PCR检测晚期蛋白A17/A27转录水平.NTV在BHK-21、CEF细胞中可有效复制和扩散,而在Vero细胞及人源细胞HeLa、2BS、Hep-2和143TK-中均不能有效复制;在HeLa细胞中,晚期蛋白A17和A27蛋白表达受阻,而转录水平基本不变.NTV是一株复制缺陷型痘苗病毒,在多种细胞中复制和扩散受限;NTV晚期蛋白A17和A27的表达受阻且与蛋白表达转录水平无关,初步判定蛋白表达受阻发生在蛋白翻译阶段.

目的:探讨DCE-MRI各参数与MVD、VEGF的关系及其临床诊断价值.方法:选取2016年3月至2017年3月间我院收治的112例乳腺疾病患者依照病理检查结果分为良性病变组及恶性病变组;使用磁共振对患者进行检查,使用Neuro-3D软件测定ADC值,使用Mean-Curve软件绘制TIC曲线,通过MIP图计算NTV,绘制TIC曲线行分型处理,并测算Slope、EER、Tpeak、SImax参数;采用免疫组化分析各病灶组织MVD、VEGF;后分析DCE-MRI各参数与MVD、VEGF的关系及其临床诊断价值.结果:NTV≥2条作为评判标准,良性病变组中病灶10.26％,恶性病变组病灶占68.00％;恶性病变组患者病灶TIC为流出型及平台型,良性病变区为平台型及单相型;恶性病变组及良性病变组患者BI RADS评分差异存在统计学意义(P＜0.05);MVD与DCE-MRI的EER、TIC类、Tpeak、NTV及ADC值显著正相关(P＜0.05),VEGF与DCE-MRI的TIC类型、Tpeak、NTV及ADC值显著正相关(P＜0.05);恶性病变组患者病灶组mMVD、cMVD及VEGF均显著高于良性病变组(P＜0.05);恶性病变组患者EER、NTV、Slope显著高于良性病变组(P＜0.05),且恶性病变组患者SImax、Tpeak及ADC显著低于良性病变组(P＜0.05).结论:MVD、VEGF与DCE-MRI的NTV、TIC类型、ADC及Tpeak存一定相关关系,上述参数可反映恶性、良性病变的血管差异,其可评估乳腺病变的生物学性质及预后治疗,影响较小.

目的 通过构建非复制型痘苗病毒修饰株NTV-C7L,在细胞和小鼠体内分别评价病毒毒力.方法 通过同源重组构建非复制型痘苗病毒修饰株NTV-C7L,通过病毒的细胞扩散能力和复制能力,以及小鼠呼吸道感染实验和小鼠尾部划痕实验分别评估NTV-C7L的体外和体内毒力.结果 经同源重组蓝白斑纯化获得的非复制型痘苗病毒修饰株NTV-C7L,通过PCR和Western blot鉴定证明C7L基因正确插入并能表达C7L蛋白;在人胚肺成纤维细胞(MRC-5)和小鼠胚胎成纤维细胞(BALB/C 3T3)中,NTV-C7L的扩散能力和复制能力比NTV强,但低于VTT;痘苗病毒小鼠滴鼻实验结果表明,106pFU病毒感染后TTV组小鼠体重与NTV及NTV-C7L组相比,体重下降差异具有统计学意义(t=6.56,P＜0.001;t=5.73,P＜0.001),NTV组与NTV-C7L组相比,体重下降差异无统计学意义(t=0.597,P=0.081);107pFU病毒感染后,NTV组及NTV-C7L组体重下降与TTV组相比,差异具有统计学意义(t=12.86,P＜0.001;t=10.71,P＜0.001).NTV组与NTV-C7L组相比,体重下降差异具有统计学意义(t=4.616,P＜0.001).小鼠尾部皮肤划痕实验表明,接种106pFU VTT组小鼠在第5天尾部形成较为明显皮肤红肿、损伤,而107pFU NTV组和NTV-C7L组仅在局部形成红肿,且范围较VTT小,后逐渐结痂愈合.结论 非复制型痘苗病毒修饰株NTV-C7L在细胞内及小鼠体内毒力较NTV升高,但明显低于VTT,为痘苗病毒载体优化及应用提供了参考数据.