目的 回顾性分析重症监护病房(ICU)与非ICU鲍氏不动杆菌分离株的耐药性、耐药基因及外排泵基因表达差异,为临床合理使用抗菌药物和多药耐药菌的防控提供科学依据.方法 对来自于2009年1月-2014年3月中山大学附属第三医院住院患者下呼吸道感染的鲍氏不动杆菌分离株213株按照来源分为ICU组(82株)和非ICU组(131株),对上述分离株进行耐药性检测,同时检测耐药基因(OXA-23、OXA-24、OXA-48、OXA-51、OXA-58、OXA-143、OXA-235、NDM-1、KPC、IMP、VIM、GIM-1、SPM-1、SIM-1、FIM-1、ISAba1 和 ISAba4)和外排泵基因(adeB、adeJ、adeG、cra A、abeM 和 amvA)、外膜蛋白基因(omp25、omp33-36、car O)的表达.结果 与非ICU组鲍氏不动杆菌分离株比较,ICU分离株对亚胺培南有更高的耐药率(达到90.2％),差异具有统计学意义(x2=7.117,P=0.008);耐药基因OXA-51检出率在ICU组和非ICU均超过95％,OXA-23、VIM在 ICU组和非 ICU 组检出率分别是 80.0％vs.60.3％(P=0.007),50.0％vs.29.0％(P=0.002);未检出OXA-48、OXA-143、OXA-235、KPC、NDM-1及SIM-1基因;ICU组和非ICU组相比,adeB相对表达量比较有统计学差异(P＜0.05).结论 ICU和非ICU组来源的鲍氏不动杆菌对亚胺培南耐药性、耐药基因(O XA-23、VIM)和外排泵基因adeB表达存在统计学差异,提示ICU鲍氏不动杆菌耐药性高可能是上述多种耐药机制的结果.

目的 分析鲍曼不动杆菌对常用抗生素的敏感性,检测外排泵基因和外膜蛋白基因的表达水平,探讨上述基因表达与抗生素耐药之间的关系.方法 选择下呼吸道标本分离的鲍曼不动杆菌共213株,对其进行菌种鉴定、药敏试验;根据药敏试验将其分为不敏感组(NS组)与敏感组(S组),应用荧光定量PCR检测外排泵基因(adeB、adeJ、adeG、craA、abeM、amvA)、外膜蛋白基因(omp25、omp33-36、carO)的表达水平,比较上述基因在NS组与S组表达水平的差异.结果 鲍曼不动杆菌对阿米卡星、亚胺培南不敏感率分别为89.2%、81.2%,对哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、庆大霉素等药物的不敏感率均超过92%.adeB基因相对表达量升高(RE≥1)在各抗生素(AMK、IPM、CFP、FEP、TZP、CAZ、SXT、CIP、SCF、CN)NS组的比例高于S组,差异有统计学意义(P<0.05).外排泵adeB基因mRNA的RE值在上述各抗生素NS组和S组之间差异有统计学意义(P<0.05),NS组adeB基因的RE值平均水平较高.外排泵adeJ、adeG、craA、abeM、amvA基因平均RE水平无升高,且经比较分析差异无统计学意义(P>0.05).外膜蛋白omp25、omp33-36、carO基因平均RE值均超过1.0,提示相对表达量升高.结论 本院鲍曼不动杆菌对多种抗生素耐药率较高.外排泵基因adeB过度表达在本院鲍曼不动杆菌耐药中起着重要作用;其余外排泵基因adeJ、adeG、craA、abeM、amvA和外膜蛋白基因omp25、omp33-36、carO在本研究的多数菌株耐药机制中可能不起作用.

目的 了解无荚膜不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)临床菌株P6外膜蛋白(OMP6)编码基因(omp6)分布及其序列保守性,筛选并鉴定OMP6序列中优势T和B细胞(T-B)联合抗原表位及其免疫原性.方法 采用PCR扩增NTHi临床菌株全长omp6基因,T-A克隆后测序.采用生物信息学软件分析OMP6序列保守性与膜定位并预测其T-B联合抗原表位.采用噬菌体展示联合免疫印迹法和ELISA分别检测重组噬菌体PⅢ蛋白(rPⅢ)展示的OMP6中T-B联合抗原表位肽免疫原性和免疫反应性.结果 35株NTHi临床菌株均能检出omp6基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.3％～100％和99.3％～100％.OMP6为外膜表面蛋白,具有OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126三个预测T-B联合抗原表位.Western Blot和ELISA结果显示,OMP6-2-25能与NTHi抗血清产生较强的杂交条带,96.9％(59/62)、69.4％(43/62)和74.2％ (46/62) NTHi感染患儿血清标本OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126抗原表位肽抗体阳性.结论 OMP6是分布广泛且序列保守的NTHi跨膜蛋白,OMP6-2-25为OMP6优势T-B联合抗原表位,可作为NTHi多抗原肽疫苗的候选表位.

目的 建立灵敏、特异、快速的LAMP检测布鲁氏菌的方法.方法 基于布鲁氏菌保守的Omp25序列设计了4套引物,根据文献合成了基于此序列的3套引物,利用7套引物建立了检测方法;应用浊度法和电泳法对4种布鲁氏菌进行检测,确定最佳引物;通过对4种布鲁氏菌和其它17种常见菌同时进行检测评价方法的特异性;通过对不同稀释浓度的4种布鲁氏菌的DNA进行LAMP检测以确定方法的灵敏度.结果 本研究新设计的一套引物被确定为最佳引物;用建立的LAMP法对17种常见菌株进行扩增,结果均为阴性,本方法具有很高的特异性;LAMP法检测猪种S2、羊种M5、牛种104 M和布鲁氏菌犬种55226四种布鲁氏菌DNA的灵敏度分别为5×10-4、5x10-5、5×10-3ng/pL和5×10-4ng/μL;检测反应在30 min以内完成.结论 本方法具有快速、灵敏、特异的特点,有望成为快速检测布鲁氏菌的有效手段.

目的 对北京地区分离自布病患者血液的2株布鲁菌进行多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)及其遗传学特征进行研究,为布病的预防和控制提供科学依据.方法 应用布鲁菌属特异性PCR(BCSP31-PCR)和种/型特异性PCR(AMOS-PCR)对分离的2株布鲁菌进行鉴定,采用MLST技术对2株布鲁菌分离株的19个管家基因、1个外膜蛋白基因及1个基因间区的序列进行测定,与MLST数据库中的等位基因序列进行比对,确定菌株的等位基因谱及9位点和21位点序列型(sequence type,ST).采用聚类分析法研究2株菌ST型与各种布鲁菌已知ST型的遗传进化关系.结果 2株分离株经BCSP31-PCR鉴定为布鲁菌属细菌,AMOS-PCR鉴定为非羊种、非牛种1、2、4型、非猪种1型、非绵羊附睾种布鲁菌;MLST分析显示,2株菌的等位基因编号(gap /aroA/glk /dnaK /gyrB /trpE/cobQ/int-hyp /omp 25/prpE/caiA/csdB/soxA/leuA/mviM/umC/fbaA/ddlA/putA/mutL /acnA)分别为2、1、2、2、1、3、1、4、1、13、2、2、2、2、1、1、3、7、6、2、3和2、1、2、2、1、3、1、4、29、13、2、2、2、2、1、1、3、7、6、2、3,比对MLST数据库,结果显示这2株细菌的等位基因编号组合未见报道,为新ST型.聚类分析显示这2种新的ST型与牛种布鲁菌ST型处于同一分支.结论 北京地区分离的2株布鲁菌为新ST型牛种布鲁菌,已被MLST数据库确认,分别命名为ST74和ST75(9位点序列型)与ST108和ST109(21位点序列型).与同属牛种布鲁菌的ST型遗传关系最近,该结果为北京地区布病的预防和控制提供了科学依据.

目的 为建立布鲁氏杆菌间接ELISA检测方法.方法 本研究根据GenBank中已登录猪种布鲁氏菌S2株全基因组序列,分别针对omp25和omp31设计一对引物,分别扩增并回收573 bp与783 bp目的基因片段,将其分别克隆入pET-28a原核表达载体中,构建重组质粒pET-OMP25与pET-OMP31,进行酶切鉴定与基因序列测定后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导表达,OMP25与OMP31蛋白主要以包涵体形式存在;将目的蛋白纯化,应用Western blot进行蛋白活性的检测.结果 纯化的目的蛋白具有良好的免疫学活性.以纯化的重组蛋白为包被抗原,在确定了OMP25与OMP31蛋白最佳配比为4∶1、抗原最佳包被浓度为10μg/mL、血清的最佳稀释倍数为1∶50倍稀释、临界值为0.314的基础上,建立羊布鲁氏菌病抗体间接ELISA诊断方法并组装成诊断试剂盒,并将试剂盒进行了特异性、敏感性、重复性、符合率试验、血清交叉反应性等检测.结论 研制的羊布鲁氏菌病抗体ELISA诊断试剂盒具有良好的特异性、敏感性,可重复性,可应用于临床样本检测.

目的:比较机器人胰腺中段切除术(robotic middle pancreatectomy,RMP)与开腹胰腺中段切除术(open middle pancreatectomy,OMP)的临床效果及术后并发症.方法:回顾分析2010年12月至2017年12月我院外科RMP及OMP病人177例临床资料,其中RMP组115例,OMP组62例.包括术前一般资料和围术期临床资料.结果:RMP组病人男41例,女74例.平均年龄为(46.9±14.2)岁,术后生化胰漏14例(12.2％),B级胰漏38例(33.0％).术后平均住院时间RMP组(24.5±12.8)d,OMP组(23.3±17.8)d(P>0.05).OMP组病人男25例,女37例,平均年龄为(53.0±13.7)岁,术后生化胰漏7例(11.3％),B、C级胰漏14例(22.6％).两组手术时间及术中出血量差异有统计学意义(P<0.001).两组共14例术后出血,其中行介入血管造影栓塞6例,二次手术6例,1例行非手术治疗,RMP组1例因术后大出血死亡.OMP组1例因急性肺栓塞死亡.结论:术后胰漏仍是胰腺中段切除术最常发生的并发症.RMP目前技术成熟安全,微创优势明显.

为探索白藜芦醇(Resveratrol,Res)在水产动物细菌病防控中的应用价值,实验以淡水养殖中重要的细菌病原嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)为研究对象,通过设置药物浓度梯度,检测其对嗜水气单胞菌生长、生物膜形成和溶血活性的抑制作用,和对毒力及群感调控系统相关基因表达的影响;同时通过人工感染异育银鲫(Carassius auratus gibelio)试验检测其对鱼体保护作用和对鱼体炎症相关因子基因表达的影响.结果显示:白藜芦醇对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)>1024μg/mL;浓度低于64μg/mL时,对菌株生长影响不显著;浓度≥32μg/mL时,对病原菌株生物膜形成和溶血活性具有显著抑制作用(P<0.05),且随剂量增加而增强.荧光定量RT-PCR结果分析发现白藜芦醇能引起嗜水气单胞菌群感调控系统中luxR和luxS基因分别显著上调和下调表达;外膜蛋白基因omp表达显著下降.人工感染试验发现攻毒前两小时腹腔注射25、50和100 mg/kg白藜芦醇处理组的异育银鲫死亡率显著下降,鱼体炎症相关的肿瘤坏死因子(TNF-α)和Ⅱ型干扰素(IFN-γ)的mRNA表达量也显著下降.研究表明药用植物大黄、虎杖等所含白藜芦醇成分能有效抑制嗜水气单胞菌毒力,降低鱼体炎症反应的功效;腹腔注射25—100 mg/kg白藜芦醇对感染病原菌的异育银鲫有一定保护作用.

目的 利用生物信息学方法对羊布鲁氏茵Omp25蛋白进行分析,预测其T细胞以及B细胞的优势抗原表位.方法 从NCBI数据库中获取羊布鲁氏茵的Omp25蛋白的氨基酸序列.应用ProtParam在线软件分析Omp25蛋白的理化性质,应用SOMPA在线软件分析Omp25蛋白二级结构,应用Phyre2及SWISS-MODEL在线软件构建并分析Omp25蛋白三级结构,应用ABCpred和BepiPred等在线软件预测Omp25蛋白的B细胞抗原表位,应用SYFPEITHI和IEDB在线软件预测Omp25蛋白的T细胞抗原表位.结果 Omp25蛋白含有23个强碱性氨基酸,含有21个强酸性氨基酸,归类为亲水性稳定蛋白,Omp25蛋白的二级结构中α-螺旋占24.88％,β-折叠占25.35％,β-转角占2.82％,无规则卷曲占46.95％.联合不同软件的预测结果分析后,最终获得1段CD4+T细胞优势抗原表位、3段CD8+T细胞优势抗原表位以及3段B细胞优势抗原表位.结论 通过生物学信息的方法较为全面地预测了羊布鲁氏茵Omp25蛋白的优势T细胞以及B细胞抗原表位,为进一步研制羊布鲁氏茵表位疫苗构建提供了理论基础.

采用十二烷基硫酸钠（SDS）化学法提取细菌外膜蛋白（OMP）用于医院内新生儿不动杆菌感染的流行病学调查中，1029次采样培养分离出不动杆菌189株，其中56株流行菌株有10条主要OMP，非流行株多1条25Kd带。4种生物型的OMP不同。比较SDS化学法与超声物理法提取OMP效果，前者更好，超声物理法需超速冷冻离心机，价格昂贵，而SDS化学法节省设备、操作简便，适宜基层医院推广。