目的:探讨分离住院患儿流感嗜血杆菌血清型、耐药性及β-内酰胺酶基因型特征，为临床诊治提供参考。方法:回顾性分析2016年1月至2018年12月首都儿科研究所附属儿童医院住院患儿临床培养分离的流感嗜血杆菌148株，应用乳胶凝集法进行荚膜血清分型，PCR法检测荚膜基因。E-test和纸片扩散法检测分离株对氨苄西林等抗菌药物的敏感性，采用 χ2检验进行耐药率的比较。头孢硝噻吩纸片法检测细菌产β-内酰胺酶表型，PCR法检测β-内酰胺酶基因TEM-1和ROB-1的携带情况。 结果:148株流感嗜血杆菌荚膜血清分型均为不可分型，未扩增出荚膜基因。菌株对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛和阿奇霉素的耐药率分别为68.9%(102/148株)、40.5%(60/148株)、53.4%(79/148株)和56.1%(83/148株)，对甲氧苄啶-磺胺甲 唑的耐药率最高，达91.9%(136/148株)。分离株对头孢曲松、美罗培南和左氧氟沙星100.0%(148/148株)敏感。β-内酰胺酶阳性菌株占64.8%(96/148株)，基因型均为TEM-1。β-内酰胺酶阳性菌株对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦和阿奇霉素的耐药率显著高于β-内酰胺酶阴性菌株( χ2＝123.222，27.973，70.273，均 P<0.01)。 结论:不可分型流感嗜血杆菌是当前儿童临床感染分离株的主要型别。不可分型流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药率较高，主要耐药机制为携带TEM-1基因。头孢曲松和美罗培南对流感嗜血杆菌保持着高度抗菌活性。

目的:研究新生儿下呼吸道流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae，Hi)分离株β-内酰胺类抗生素耐药趋势变化与分子耐药机制。方法:对19株新生儿Hi分离株进行再鉴定，通过PCR法测菌株P6、fucK和Cap基因进行血清学分型，用肉汤微量稀释法检测氨苄西林、阿莫西林克拉维酸和头孢呋辛最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)；对TEM-1、ROB-1和ftsI基因进行测序和变异分析。结果:(1)19株Hi经P6、fucK和Cap基因检测证实均为无荚膜型，即不可分型流感嗜血杆菌(non-typeable Haemophilus influenzae，NTHi )。(2)与2003至2004年比较，2013至2014年新生儿下呼吸道NTHi分离株氨苄西林、阿莫西林克拉维酸和头孢呋辛的MIC值明显增高，差异有统计学意义( P<0.05)。(3)2003至2004年( n＝9)和2013至2014年( n＝10)产β-内酰胺酶菌株均为3株，10年间比较差异无统计学意义( P>0.05)；BLA基因检测显示6株产β-内酰胺酶均为TEM-1型，未检测出ROB-1型菌株。(4)2003至2004年仅出现1株基因型β-内酰胺酶阳性氨苄西林耐药(gBLPAR)，2013至2014年出现基因型β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药(gBLNAR)1株、基因型β-内酰胺酶阴性氨苄西林中介(gBLNAI)3株、gBLPAR 3株、基因型β-内酰胺酶阳性阿莫西林克拉维酸耐药(gBLPACR)1株。(5)2013至2014年ftsI基因出现了11个氨基酸替代模式，而2003至2004年仅出现5个氨基酸替代模式；10年间比较ftsI基因S357N、S385T、N526K、T532S变异率显著增加，差异有统计学意义( P<0.05)。1株2014年分离的耐氨苄西林、阿莫西林克拉维酸和头孢呋辛的gBLNAR/gBLNACR菌株同时出现D350N、S357N、M377I、S385T、L389F、A502T、N526K变异。 结论:新生儿下呼吸道NTHi感染患儿或将迅速面临β-内酰胺类抗生素多重耐药的严峻挑战。

目的 探究慢性中耳炎(chronic otitis media,COM)小鼠中Treg细胞与炎症发展之间的关系.方法 采用不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)腹腔注射和中耳咽鼓管(ET)阻断的方式诱导构建慢性中耳炎小鼠模型(模型组),选择健康BALB/c小鼠作为对照组.分别在建模后第3,14,28,56天分离收集小鼠中耳积液和中耳黏膜组织,通过苏木精-伊红(HE)染色检测MEM病理变化,采用免疫组织化学染色评估CD4+和Foxp3+T细胞水平,ELISA和Western blot分别检测小鼠中耳积液和中耳黏膜组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-10和转化生长因子(TGF-β)水平,流式细胞术分析CD4+CD25+Foxp3+细胞比例.另取COM模型小鼠分为PBS组和抗-CD25组.抗-CD25组小鼠腹腔注射抗CD25 mAb模拟体内Treg耗竭,PBS组小鼠腹腔注射等量PBS溶液,第56天收集小鼠中耳积液、中耳黏膜组织、脾脏和颈部淋巴结组织,检测分析脾脏、颈部淋巴结和中耳黏膜组织中CD4+CD25+Foxp3+细胞比例,中耳黏膜组织中炎性因子水平,以及中耳积液中细菌水平.结果 HE结果显示,对照组小鼠中耳黏膜组织正常,模型组小鼠中耳黏膜组织出现炎性细胞浸润,细菌数量、炎性细胞数量和黏膜厚度均增加(P＜0.05).与对照组比较,模型组小鼠中耳黏膜组织中CD4+CD25+Foxp3+细胞比例升高(P＜0.05),中耳积液和中耳黏膜组织中炎性因子IL-1 β、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平均升高(P＜0.01).与PBS组比较,抗-CD25组小鼠中耳黏膜组织、脾脏和颈部淋巴结组织中CD4+CD25+Foxp3+细胞比例均降低(P＜0.05),中耳积液中细菌数和中耳黏膜组织中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平均降低(P＜0.01).结论 Treg细胞在慢性中耳炎的炎症平衡维持中具有重要作用,抑制炎症的进展,但过度的Treg细胞抑制了宿主对细菌的清除作用.

目的 探讨不可分型流感嗜血杆菌生物膜在儿童慢性肺部感染中的作用.方法 从临床微生物室样本库中选取2019年2月至2021年10月从健康儿童(健康对照组)鼻咽部和肺部感染儿童(肺部感染组)肺泡灌洗液中分离培养的流感嗜血杆菌,比较健康儿童与急性和慢性肺部感染患儿分离菌株体外生物膜在不同时间点的生成情况.结果 选取流感嗜血杆菌89株,其中健康对照组34株,慢性肺部感染组30株,急性肺部感染组25株.所有菌株通过聚合酶链反应对荚膜基因bexA的检测发现,均为不可分型流感嗜血杆菌.急性和慢性肺部感染组在不同时间点(第1、2、3、4、7天)之间的吸光度差异有统计学意义,慢性感染组在第4天的吸光度最高.第4天健康对照组、急性和慢性肺部感染组之间的吸光度差异有统计学意义(P＜0.05),慢性肺部感染组吸光度高于健康对照组和急性肺部感染组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 不可分型流感嗜血杆菌生物膜的生成需要较长时间,在慢性肺部感染患儿中生成能力高于急性肺部感染患儿和健康对照儿童.

目的:E蛋白(Protein E,PE)是不可分型流感嗜血杆菌(Nontypeable Haemophilus influenza,NTHi)表面的一种纤溶酶原(plasminogen,Plg)受体,其C末端含有两个赖氨酸残基.NTHi可通过其表面的PE与Plg结合,从而利用机体的纤溶系统深层入侵宿主.基于脂蛋白(a)[Lipoprotein (a),Lp(a)]中载脂蛋白(a)[Apolipoprotein (a),Apo(a)]与Plg高度的同源性,拟证明Lp(a)是否会与重组表达的PE(rPE)结合.方法:原核表达并纯化rPE及敲除C末端两个赖氨酸残基的rPEAKK,密度梯度离心结合阴离子交换层析分离人血浆Lp(a),通过ELISA、Pull down、Western blot等方法研究rPE与Lp(a)的相互作用.结果:rPE与Lp(a)结合,但不与LDL结合,且rPEAKK与Lp(a)的结合能力明显低于rPE;赖氨酸类似物6-氨基乙酸(EACA)能有效抑制rPE与Lp(a)的结合;Lp(a)对rPE与Plg的结合具有微弱的抑制作用.结论:rPE能够与Lp(a)结合,其中rPE的C末端赖氨酸残基和Apo(a)的赖氨酸结合位点(lysine binding sites,LBS)是rPE与Lp(a)结合的主要位点.

目的 了解无荚膜不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)临床菌株P6外膜蛋白(OMP6)编码基因(omp6)分布及其序列保守性,筛选并鉴定OMP6序列中优势T和B细胞(T-B)联合抗原表位及其免疫原性.方法 采用PCR扩增NTHi临床菌株全长omp6基因,T-A克隆后测序.采用生物信息学软件分析OMP6序列保守性与膜定位并预测其T-B联合抗原表位.采用噬菌体展示联合免疫印迹法和ELISA分别检测重组噬菌体PⅢ蛋白(rPⅢ)展示的OMP6中T-B联合抗原表位肽免疫原性和免疫反应性.结果 35株NTHi临床菌株均能检出omp6基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.3％～100％和99.3％～100％.OMP6为外膜表面蛋白,具有OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126三个预测T-B联合抗原表位.Western Blot和ELISA结果显示,OMP6-2-25能与NTHi抗血清产生较强的杂交条带,96.9％(59/62)、69.4％(43/62)和74.2％ (46/62) NTHi感染患儿血清标本OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126抗原表位肽抗体阳性.结论 OMP6是分布广泛且序列保守的NTHi跨膜蛋白,OMP6-2-25为OMP6优势T-B联合抗原表位,可作为NTHi多抗原肽疫苗的候选表位.

目的 分析儿童呼吸道感染流感嗜血杆菌(H.influenzae)的临床特征与耐药性,为临床预防感染和合理用药提供依据.方法 回顾性分析2013年1月-2016年12月东莞市常平医院儿科门诊和住院的2177例呼吸道感染患儿的临床资料.结果 4年间共分离出流感嗜血杆菌209株,检出率为9.6％,流感嗜血杆菌感染主要集中在0岁～＜1岁、冬季和城市患儿,检出率分别为16.0％、13.3％和12.2％;血清学分型以不可分型为主,占51.7％;流感嗜血杆菌对常用抗菌药物的耐药率总体呈上升趋势,对氨苄西林、复方新诺明保持较高的耐药性,总耐药率分别为41.1％、75.6％,连续4年,流感嗜血杆菌产β-内酰胺酶率保持上升趋势,总产酶率为41.1％.结论 本地区流感嗜血杆菌在冬季高发,易引起3岁以下患儿呼吸道感染,血清学分型以不可分型为主,流感嗜血杆菌产β-内酰胺酶率逐年升高,对不同抗菌药物的耐药性随着时间而变化,临床应根据药敏试验结果合理选用抗菌药物.

目的 了解本地区呼吸道流感嗜血杆菌(H.influenzae)的感染状况、流行病学特征及耐药性,为临床经验治疗提供参考.方法 回顾性分析2011年1月1日-2017年12月31日呼吸道H.influenzae感染患者的临床资料.结果 H.influenzae的总检出率为10.6％ (172/1627);不同性别、不同标本类型、不同科室、不同年龄、不同季节H.influenzae的检出率差异均有统计学意义(P＜0.05);H.influenzae以不可分型株为主(67.4％);产β-内酰胺酶率为44.8％,儿童与成人产酶率差异有统计学意义(P＜0.05);H.influenzae对氨苄西林、阿莫西林、复方新诺明、四环素和氯霉素的耐药率分别为45.9％、55.8％、65.1％、42.4％和33.1％,产酶株对氨苄西林、阿莫西林、复方新诺明、四环素和氯霉素的耐药率显著高于非产酶株(P＜0.05).结论 本地区呼吸道感染患者H.influenzae检出率较高,呈明显的季节性分布,常见于不可分型株,产β-内酰胺酶率高,对氨苄西林、阿莫西林、复方新诺明、四环素和氯霉素的耐药率较高.

目的 克隆不可分型流感嗜血杆菌ATCC49247外膜蛋白P6基因,并对其编码蛋白进行分析. 方法 以标准菌株ATCC49247NTHI DNA为模板,PCR扩增P6目的基因,构建重组质粒pGEX-6P2/P6并测序,利用生物信息软件和GenBank数据库对编码外膜蛋白P6进行同源性分析,预测其主要理化性质、结构功能、B细胞抗原表位和T细胞抗原表位. 结果 ATCC49247 P6基因核苷酸序列长度为462 bp,与不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因核苷酸同源性为99.17％～100％,编码蛋白氨基酸同源性为96.18％～100％.编码蛋白含有153个氨基酸,相对分子质量为16.137 94×103,等电点6.09,为亲水性蛋白;该蛋白含有信号肽和3个结构域,无跨膜结构域;综合蛋白质的二级结构、亲疏水性、柔性、表面可及性和抗原指数预测该蛋白含有6个优势B细胞抗原表位,有7个CTL细胞抗原表位及16个Th细胞抗原表位. 结论 成功克隆外膜蛋白P6基因,生物信息学方法 预测分析ATCC49247外膜蛋白P6高度保守,免疫原性强,可作为流感嗜血杆菌候选疫苗和疫苗载体.

目的 探讨清肺消炎丸对不可分型流感嗜血杆菌诱导肺部炎症小鼠的影响.方法 50只小鼠随机分为空白组、模型组、氨苄西林组(0.288 mg/kg)、麻杏石甘汤组(6.05 g/kg)、清肺消炎丸组(2.16 g/kg),每组10只.给药7d后,测定一般情况(体质量及肺、脾、胸腺指数),HE染色观察肺组织病理变化,ELISA法检测血清炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、GCSF、TNF-α)水平,Western blot及RT-PCR法分别检测肺组织TLR4、MyD88、TRAF6蛋白及mRNA表达.结果 与模型组比较,清肺消炎丸组一般情况显著改善(P＜0.01),炎性细胞因子水平,TLR4、MyD88、TRAF6蛋白及mRNA表达显著降低(P＜0.01).结论 清肺消炎丸可缓解不可分型流感嗜血杆菌诱导肺部炎症小鼠肺损伤和炎症,其机制可能与调控被激活的TLR4-MYD88-TRAF6信号通路、抑制炎性细胞因子分泌有关.