目的:评价Toll样受体4(TLR4)/Src信号通路在肝缺血再灌注大鼠海马NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体激活中的作用。方法:清洁级健康雄性SD大鼠32只，8周龄，体重约200 g。采用随机数字表法分为4组( n＝8)：假手术组(Sham组)、肝缺血再灌注组(HIR组)、TLR4抑制剂TAK-242组(TAK-242组)和Src抑制剂PP2组(PP2组)。采用夹闭肝脏血管1.5 h恢复灌注的方法制备大鼠肝缺血再灌注损伤模型，TAK-242组于模型制备前30 min尾静脉注射TAK-242 0.5 mg/kg，PP2组于模型制备前3 d连续腹腔注射PP2 0.03 mg/kg。于再灌注6 h时处死大鼠取海马，采用ELISA法检测IL-1β和IL-18含量；采用TBA法检测MDA含量，采用总超氧化物歧化酶法检测SOD活性；采用Western blot法检测NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、c-Src、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1前体(pro caspase-1)、裂解含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cleaved caspase-1)、TLR4和p-Src的表达。 结果:与Sham组比较，其余3组海马IL-1β、IL-18和MDA含量升高，SOD活性降低，NLRP3、cleaved caspase-1、ASC、TLR4和p-Src表达上调( P<0.05)；与HIR组比较，TAK-242组和PP2组IL-1β、IL-18和MDA含量降低，SOD活性升高，NLRP3、cleaved caspase-1、ASC、TLR4和p-Src表达下调( P<0.05)；TAK-242组和PP2组各指标比较差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:肝缺血再灌注大鼠海马NLRP3炎症小体激活的机制与活化TLR4/Src信号通路有关。

目的:了解功能性胃肠病(functional gastrointestinal disorders,FGIDs)居民中中医食养食疗知信行情况,并分析相关因素.方法:采用《罗马Ⅳ诊断性问卷》和自行设计的《中医食养食疗与胃肠健康素养问卷》进行网络问卷调查,应用二元Logistic回归分析有无FGIDs症状及与中医食养食疗知信行之间的关系.结果:通过网络共收集344份有效问卷,被调查居民FGIDs有症状者占比70.35%(242/344),对于便秘、慢性腹泻的饮食禁忌以及胃酸过少的食养食疗认知正确率最低(均＜50%).有症状者中医食疗认可度高于无症状者(χ2=7.53,P=0.023),食疗产品服用时间长于无症状者(χ2=8.327,P=0.016).有症状者多选用补虚类食疗产品,消食类、理气类次之(χ2=8.782,P=0.032).Logistic回归分析显示,胃酸过少的食养食疗认知、消化溃疡的饮食禁忌、应用中医知识指导饮食的态度以及喜食生冷、刺激性食物是有FGIDs症状的重要影响因素(P＜0.05).结论:有FGIDs症状者中医食养食疗认知水平较差,态度积极,饮食健康行为有待改善.而加强中医食养食疗宣传和指导对居民防治FGIDs具有积极作用.

目的 探讨调控哺乳动物雷帕霉素蛋白复合物2(mTORC2)/Akt信号通路对6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤的SH-SY5Y细胞系是否具有保护作用,并阐明其分子作用机制.方法 经维甲酸(RA)处理的SH-SY5Y细胞分别给予6-OHDA、mTORC2信号通路抑制剂PP242和激动剂A-443654,通过免疫荧光染色观察各组细胞数目的变化;提取细胞总蛋白进行Western blotting和免疫共沉淀(CoIP)实验,明确mTORC2信号通路关键蛋白的表达水平及其相互作用;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率.同时制备SH-SY5Y与Bv-2细胞系共培养的帕金森病(PD)模型,运用MTT及ELISA方法检测各组细胞活力及培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素β(IL-1β)的含量.结果 6-0HDA损伤的PD细胞模型组酪氨酸羟化酶(TH)/增殖细胞核抗原(PCNA)/Hochest-、TH/5-溴脱氧尿嘧啶核昔(BrdU)-单标或双标阳性细胞数较正常组明显减少,凋亡率升高;Rictor、p-Akt、发育及DNA损伤反应调节蛋白1(REDD1)的表达均上升,且Rictor与p-Akt或REDD1存在相互作用;共培养模型中细胞活力明显降低且上清液中TNF-α和IL-β含量上升.A-443654组随着上述蛋白表达的进一步上调,细胞存活和凋亡以及炎性因子水平均有明显改善,而PP242组则呈现相反的变化.结论 A-443654通过使Akt磷酸化而激活mTORC2信号通路,引起Rictor和REDD1蛋白的表达增加,继而提高细胞存活率并降低凋亡率,促进SH-SY5Y细胞的增殖分化,改善了 6-0HDA引起的细胞损伤以及抑制了炎症因子的释放.

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of ra-pamycin,mTOR)信号通路异常与多种肿瘤的形成、细胞的恶性转化相关.乳腺癌、胃肠道间质的肿瘤、肝癌、肺癌等均发现mTOR通路的异常激活,从而降低了肿瘤对化疗、放疗的敏感性[1].急性淋巴细胞白血病也存在Akt/mTOR信号通路的过度激活[2].鉴于mTOR在信号转导和细胞增殖中的重要作用,其特异性抑制剂如雷帕霉素,成为了潜在的具有抗肿瘤作用的药物.本研究拟通过阐明二代mTOR抑制剂PP242对急性T细胞白血病Jurkat细胞株增殖以及Akt/mTOR信号通路的影响,探讨PP242成为急性T淋巴细胞白血病的治疗靶点的可能性.

目的 探讨 mTORC1/2 抑制剂 PP242 诱导多囊肾(polycystic kidney,PCK)大鼠胆管上皮细胞凋亡和自噬、抑制细胞增殖及胆管囊性扩张的分子机制.方法 免疫组织化学染色法检测PCK大鼠胆管上皮细胞中p-mTOR和p-Akt的表达;WST-1比色法检测雷帕霉素和PP242对胆管上皮细胞增殖活性的抑制作用,以及LC3、Beclin-1基因沉默和自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对细胞增殖的影响;蛋白免疫印迹法检测PP242 对PI3K/Akt信号通路相关蛋白、自噬标识蛋白 LC3 和 Beclin-1、 cleaved caspase-3表达的影响;流式细胞术和 ELISA 法检测 PP242对细胞凋亡的影响;免疫荧光染色法检测LC3 在细胞质中的表达情况;3D细胞培养检测Rictor基因沉默和雷帕霉素联用及雷帕霉素单独应用时对大鼠胆管上皮细胞成球能力的影响.结果 p-mTOR和 p-Akt在 PCK大鼠胆管上皮细 胞中呈过表达,PP242比雷帕霉素抑制胆管上皮细胞增殖效果更为明显,且呈浓度和时间依赖性改变(P<0.05);PP242明显抑制PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达;PP242 可诱导细胞凋亡和自噬,上调cleaved caspase-3、Beclin-1 和LC3-II/LC3-I比值. Rictor基因沉默和雷帕霉素联用比雷帕霉素单独应用对大鼠胆管上皮细胞的抑制作用更为明显;LC3、Beclin-1基因沉默和3-MA均可明显减弱PP242对细胞增殖的抑制作用(P <0.05).结论 PP242 可通过 PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制PCK大鼠胆管上皮细胞的增殖,其机制与细胞凋亡和自噬密切相关.

目的 研究PP242对人晶状体上皮细胞(HLECs)凋亡的诱导及凋亡蛋白Bax表达的影响.方法 用不同浓度PP242处理人晶状体上皮细胞系SRA01/04,分别用浓度为0、250、500、750、1 000 nmol/L的PP242处理HLECs 48 h后,Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率;采用实时定量PCR及Western blotting方法检测Bax的mRNA及蛋白的表达.结果 250、500、750和1 000 nmol/L PP242对人晶状体上皮细胞系SRA01/04作用48 h后,早期凋亡率分别为7.20％±0.36％、13.77％±0.21％、16.31％±0.20％和18.67％±0.49％,与对照组(0 nmol/L)差异有统计学意义(P＜0.05).Western blotting结果显示,随着PP242浓度的增加,Bax蛋白表达量增加,与对照组(0 nmol/L)比较差异有统计学意义(P＜0.05);实时定量PCR结果显示,Bax mRNA表达量随PP242药物浓度的增加而增加,相对定量mRNA结果分别为2.157±0.125、3.733±0.302、5.596±0.261和7.436±0.167,与对照组(0 nmol/L)比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PP242可以诱导HLECs的凋亡,增加其凋亡蛋白Bax的表达.

目的 探讨特立帕肽通过mTORC2通路调控骨髓间充质干细胞的细胞骨架和黏附斑的变化的机制.方法 从4～6周大的Sprague-Dawley大鼠中提取骨髓间充质干细胞并培养,使用不同浓度(1、10、20、50 nmol/L)的特立帕肽处理细胞.特立帕肽处理细胞后加入mTORC1抑制剂(20 nmol/L雷帕霉素)或mTORC1/2抑制剂(10μmol/L PP242)后观察现象.细胞迁移采用细胞迁移试验和伤口愈合试验.通过黏附实验观察细胞的黏附能力.蛋白表达的细胞骨架蛋白(β-actin)和黏着斑蛋白(vinculin)用免疫荧光检测.结果 在不同浓度特立帕肽的处理下,大鼠的骨髓间充质干细胞相对于对照组呈现出更强的迁移和黏附能力(P<0.05);此外,与1 nmol/L的特立帕肽的浓度相比,10、20、50 nmol/L浓度的特立帕肽均能促进细胞迁移,且处理间差异无统计学意义(P>0.05);在特立帕肽的刺激下,细胞更大,呈多边形,并且actin应力纤维倾向于有更强的粘连;而加入mTORC1/2抑制剂PP242的骨髓间充质干细胞能显著降低特立帕肽促进迁移和黏附的能力,并且细胞的黏着斑与肌动蛋白末端的骨架纤维较小;加入mTORC1抑制剂雷帕霉素对特立帕肽的抑制作用和则不明显.结论 特立帕肽通过激活mTORC2通路调控细胞骨架和黏附斑的变化,进而促进细胞的迁移黏附.

目的 探讨哺乳动物雷帕霉素复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)信号通路在周期性单轴牵张力作用下对小鼠骨髓间充质细胞(bone marrow mesenchymal cells,BMMSCs)的成骨分化的作用.方法 对体外分离培养的小鼠BMMSCs施加形变量10％的单轴动态牵张力,在牵张后0、1、2、4、8 h利用western blot检测内源性mTORC1信号通路主要分子mTOR、Raptor、核糖体蛋白S6激酶(ribosomal proteinS6 kinases,S6K)的表达变化,并利用化学比色法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性变化,ELISA法检测检测骨钙素(osteocalcin,OCN)表达量,RT-PCR法检测Runt相关转录因子(Runt-related transcription fac-tor 2,Runx2)的mRNA表达变化.将BMMSCs分为抑制组、激活组及对照组,分别加入工具药PP242、MHY1485及PBS,加力2 h后用上述方法检测S6K与成骨信号相关因子的活性或表达变化.结果Western blot结果显示,mTORC1信号通路主要分子在牵张力作用后的8 h内均有表达,并在加力后2 h表达最高.与对照组相比,抑制mTORC1信号通路表达后,ALP活性、OCN表达下降,Runx2的mRNA水平上升,差异均具有统计学意义(P<0.001);激活mTORC1信号通路表达后,ALP活性、OCN表达上升,而Runx2 mRNA水平下降,差异均具有统计学意义(P<0.001).结论 mTORC1信号通路参与了牵张力下小鼠BMMSCs成骨分化过程,激活该信号通路可以促进其成骨分化.

目的 探讨高糖诱导的小鼠肾足细胞增殖、凋亡和Podocin蛋白表达的变化以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂PP242的干预效应.方法 以体外培养的条件永生性的小鼠肾足细胞为研究对象,将足细胞分为4组.正常组给予葡萄糖5.5 mmol/L;高糖组给予葡萄糖30 mmol/L;PP242干预1组给予葡萄糖30 mmol/L、1μmol/L PP242;PP242干预2组给予葡萄糖30 mmol/L、10μmol/L PP242.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测PP242对高糖诱导的足细胞增殖的影响,用流式细胞仪检测PP242对高糖诱导的足细胞凋亡的影响,用Western Blot方法 检测PP242对高糖诱导的足细胞Podocin蛋白表达.结果 高糖诱导足细胞48 h后,与正常组比较,高糖组细胞增殖减少,细胞凋亡增加,Podocin蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05).高糖诱导经PP242干预后,与高糖组比较,PP242干预1组、PP242干预2组足细胞增殖增加,足细胞凋亡减少,Podocin蛋白表达明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 PP242可以部分减少高糖诱导的足细胞损伤,具有潜在的足细胞保护作用.

目的 探讨山奈酚(kaempferol,Kae)对周期性单轴牵张力下小鼠骨髓间充质细胞(bone marrow mes-enchymal cells,BMMCs)成骨分化过程中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin com-plex 1,mTORC1)信号通路的作用.方法 对体外分离培养的小鼠BMMCs施加形变量10％的单轴动态牵张力,通过细胞毒性试验筛选出合适浓度Kae,并添加工具药pp242改变内源性mTOR信号,在牵张后4 h利用化学比色法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性变化、ELISA法检测骨钙素(osteocalcin,OCN)表达量,流式细胞仪检测细胞内钙离子相对含量;利用Western Blot检测内源性mTORC1信号通路主要分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、核糖体蛋白S6激酶(ribosomal proteinS6 kinases,S6K)、4E/BP1的磷酸化表达及成骨转录因子Runx2和Osterix的表达变化,qRT-PCR检测上述因子mRNA表达水平.结果 10μmol/L Kae对细胞的抑制作用较小,且成骨能力最强.加力结束后4 h,Kae能够有效促进BMMCs成骨分化,ALP表达为(153.04±18.72)U/mg,OCN表达为(1.64±0.25)U,成骨转录因子Runx2、Osterix的mRNA水平和蛋白水平表达上调,细胞内钙离子含量下降,同时mTORC1信号通路中mTOR、S6K mRNA水平及蛋白磷酸化表达上调,4E/BP1 mRNA水平及蛋白磷酸化表达下调;在加入pp242抑制mTORC1信号表达后,mTOR、S6K mRNA水平及蛋白磷酸化表达下调,4E/BP1 mRNA水平及蛋白磷酸化表达上调,BMMCs成骨分化效应显著被抑制,Runx2、Osterix的mRNA水平和蛋白表达显著下调,ALP及OCN表达下调,细胞内钙离子含量增高.结论 Kae通过mTORC1信号通路促进牵张力下小鼠BMMCs成骨分化.