目的:探讨聚凝胺对小鼠骨髓源树突状细胞(BMDCs)的毒性作用以及聚凝胺促慢病毒载体转染BMDCs的最佳浓度。方法:制备BMDCs悬液，随机分为实验组和对照组。实验组用不同浓度的聚凝胺处理，对照组中加入等量磷酸盐缓冲液(PBS)，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙锭(PI)双标记法评价聚凝胺对BMDCs的毒性作用。向BMDCs悬液中加入慢病毒载体[感染复数(MOI)＝10]，实验组用不同浓度的聚凝胺处理，对照组加入等量PBS，每天采用荧光显微镜动态观察各组绿色荧光蛋白(GFP)表达。刺激BMDCs成熟后，采用流式细胞术定量检测GFP表达。各组之间两两比较采用独立样本 t检验。 结果:聚凝胺浓度≥11 mg/L时，活细胞数目显著减少[吸光度( A)值(0.881±0.007)比(1.031±0.017)， t＝7.832， P<0.05]，差异有统计学意义。安全浓度范围内，使用聚凝胺能显著提高GFP表达，聚凝胺浓度为8 mg/L时，GFP表达最高。 结论:聚凝胺对BMDCs存在剂量依赖的毒性作用，安全浓度范围内，聚凝胺可明显提高慢病毒载体对BMDCs的转染率，最适浓度为8 mg/L。

目的:探讨不同免疫抗体检测技术在临床输血中的应用价值。方法:选取2019年1月至2021年1月在徐州医科大学附属医院需要进行临床输血治疗的1968例患者，分别采用微柱凝胶抗球蛋白法(microcolum gel Coomb's test，MGCT)、凝聚胺法、固相凝集法进行输血前抗体检测，以谱细胞检测为金标准，采用kappa一致性检验对比分析三种技术检测的一致性。结果:MGCT和凝聚胺法检测不规则抗体与谱细胞鉴定的一致性Kappa值分别为0.84和0.72。MGCT与凝聚胺法检测不规则抗体效能的特异度及阴性预测值差异均无统计学意义( P>0.05)，而MGCT检测的灵敏度、阳性预测值明显高于凝聚胺法检测，差异具有统计学意义(81.82%比72.73%，85.71%比72.73%， χ2值分别为5.01、5.17， P值均<0.05)。MGCT和固相凝集法检测血小板抗体与谱细胞检测一致性的Kappa值分别为0.83和0.75。MGCT与固相凝集法检测血小板抗体效能的特异度及阳性预测值差异均无统计学意义( P>0.05)，而MGCT检测的灵敏度和阴性预测值明显高于固相凝集法检测，差异具有统计学意义(90.17%比84.10%，81.19%比74.64%， χ2值分别为6.53、6.11， P值均<0.05)。 结论:固相凝集法、凝聚胺法与MGCT比较，MGCT进行输血前免疫抗体检测效果显著，不仅可进行红细胞不规则抗体筛查，还可以进行血小板抗体筛查，值得临床推广。

目的:通过对2021年度淮南地区无偿献血者的血型检测基本情况的统计，分析ABO、RhD血型的分布，为血液招募、临床用血及稀有血型的应急保障提供数据支持。方法:采用Metis150-8血型全自动分析仪及手工盐水法、抗人球及凝聚胺法，检测2021年度符合献血条件的24 484例无偿献血者的ABO和RhD血型，并对血型检测结果进行统计分析。结果:2021年度淮南地区24 484例无偿献血者的ABO血型系统中，血型比例由高到低的顺序为A型（7 463例，30.48%）、O型（7 444例，30.40%）、B型（7 056例，28.82%）、AB型（2 521例，10.30%）。共检出RhD阴性143例，RhD阴性频率为0.58%（143/24 484）；在RhD阴性样本中，A型、B型、O型和AB型RhD阴性分别为43例、41例、46例、13例，分别占30.07%、28.67%、32.17%和9.09%，淮南地区不同ABO血型人群RhD阴性检出率差异无统计学意义（χ 2=0.36， P=0.948）。2021年度淮南地区无偿献血者ABO血型分布与广州地区、岳阳地区、新疆博州、漳州地区、柳州地区的无偿献血者ABO血型分布特征不完全相同，其中岳阳地区A型献血者占比高于其他地区，淮南地区、新疆博州和漳州地区B型献血者占比高于其他地区，柳州地区O型献血者占比高于其他地区，淮南地区和新疆博州AB型献血者占比高于其他地区。 结论:淮南地区无偿献血者ABO和RhD血型分布具有一定的地区性特征，中心血站和各医疗机构应根据无偿献血采集情况和临床输血需求合理做好血液贮存和供应，防止造成血液过期浪费等情况的发生。

目的 通过对ABO血型为Ax22/B型的患者及其家属因A亚型造成血清学血型鉴定错误的案例进行分析,总结ABO血型鉴定过程中的注意事项及A亚型的输血策略.方法 分别选取A、B两种不同厂家的微柱凝胶血型鉴定卡及试管法在常温和4 ℃孵育10 min两种条件下对患者及其子女进行血清学血型鉴定;对所有标本进行吸收放散试验及血型基因鉴定;分别用微柱凝胶法和聚凝胺法对同一组标本进行交叉配血.结果 B试剂卡凝集强度明显高于A试剂卡,且正定型B试剂卡可以在常温下检测到A抗原,A试剂卡仅在4℃孵育10 min后才可检测到A抗原.试管法血型可明确显示A亚型的反应格局.吸收放散试验显示所有标本红细胞表面均存在A抗原,经基因测序患者为Ax22/B.01,其子女基因型为Ax22/O.01.01.微柱凝胶法交叉配血相合,聚凝胺法镜下可见细胞凝集,交叉配血不合.结论 Ax22会造成检测结果假阴性,如正反定型不一致或者对检测结果有任何疑问,应选用试管法或其他检测系统进行复核,必要时进行基因检测;Ax22亚型在配血时有假阴性的可能,有较高的输血风险.

目的 观察达雷妥尤单抗对凝聚胺技术检出IgG类抗D抗体的影响.方法 选取10份AB型RhD阳性、不规则抗体筛查阴性的血浆样本,将每份标本各分装2 mL于3个试管中,分为3组,抗筛阴性对照组不做任何处理;加入IgG类抗D抗体的作为抗筛阳性对照组;加入达雷妥尤单抗(400 mg/20 mL)和IgG抗D试剂作为实验组.使用微柱凝胶卡法和凝聚胺法分别进行不规则抗体筛查试验,观察IgG抗D抗体的检出.结果 微柱凝胶卡法的抗体筛查试验结果显示:实验组(23.80±1.40)与阳性对照组(18.80±1.40)评分比较,差异有统计学意义(P＜0.05);凝聚胺法的抗体筛查试验结果显示:实验组(14.80±2.53)与阳性对照组(14.80±2.53)评分比较,无统计学意义(P＞0.05);且倍比稀释后实验组凝聚胺法对IgG抗D的检出下限同阳性对照组一致(1:64).结论 达雷妥尤单抗对凝聚胺法检出IgG类抗D抗体无影响,达雷妥尤单抗对微柱凝胶卡法检出IgG类抗D抗体有影响.

目的:研究shRNA降低p62基因表达对人宫颈腺癌HeLa细胞增殖的影响.方法:构建具有沉默p62表达的慢病毒载体短发夹RNA(shRNA)序列,采用Polybrene将其转染入宫颈腺癌HeLa细胞中(shRNA组),设立shNC作为阴性对照组,另设未加慢病毒转染载体的空白对照组.采用实时荧光定量qRT-PCR技术检测各组相对空白对照组的p62基因相对表达量;采用CCK-8实验检测3组细胞的增殖情况,采用集落克隆形成实验检测3组细胞的克隆形成率.结果:沉默p62基因表达的宫颈癌HeLa细胞成功构建;shRNA组p62mRNA相对空白对照组的相对表达量为(0.18 ± 0.08),而shNC组的p62mRNA相对空白对照组的相对表达量为(1.01 ± 0.12)(t=9.97,P<0.01);shRNA的干扰效率为81.00%;shRNA组较阴性对照组和空白对照组细胞增殖速度变慢(P<0.05),克隆形成率减少(P<0.01).结论:p62基因沉默后,宫颈癌HeLa细胞的增殖速度变慢.p62基因在宫颈癌HeLa细胞的增殖中起着重要的作用.

背景:研究表明成骨细胞特异性转录因子(Runx2)的杂合突变、基因插入、缺失等是造成颅骨锁骨发育不全的重要原因.目前关于Runx2基因沉默后成骨细胞功能会发生怎样的变化,及如何沉默成骨细胞Runx2基因表达的相关研究未见报道.目的:构建靶向Runx2基因的小鼠成骨样细胞MC3T3-E1慢病毒载体,为颅骨锁骨发育不全的研究提供实验依据.方法:根据预实验结果在含5 mg/L Polybrene的ENi.S培养液中,病毒按MOI=40进行感染,按病毒序号分为4组:NC组:pFU-GW-016PSC53349-1;KD1组:LVpFU-GW-016PSC60107-1;KD2组:LVpFU-GW-016PSC60108-1;KD3组:LVpFU-GW-016PSC60109-1.转染后16 h换液,72 h后,Celigo全视野细胞扫描分析仪观察检测基因的表达情况;两步法进行Real-Time PCR检测Runx2基因的沉默效果.结果与结论:①病毒转染后72 h,NC组未见荧光表达;KD1组可见少量荧光表达;KD2组荧光表达增强;KD3组可见强绿色荧光;②Real-Time PCR结果提示KD3组获得较好Runx2基因沉默效果;③实验成功构建靶向Runx2基因的MC3T3-E1细胞慢病毒载体,筛选出特异性抑制成骨细胞Runx2基因的病毒,并初步确定其作用的时间、相应的计量.

目的 通过使用微柱凝胶卡式法进行Coombs试验, 确定导致自身免疫性溶血性贫血患者的自身抗体类型, 从而在临床输血过程中注意此种情况, 减少输血反应.方法 用微柱凝胶卡式法检测患者直接抗人球蛋白试验, 分别用微柱凝胶检测卡法和凝聚胺法对患者进行主、次侧交叉配血试验, 以明确该类患者在交叉配血时所需采用的试验方法.结果 患者DAT试验结果为阳性, 具体抗体分型为IgA型;微柱凝胶法交叉配血患者主、次侧交叉配血试验结果均为阴性;凝聚胺法主、次侧交叉配血结果均为阳性.结论 单独型IgA抗体的AIHA患者, 除微柱凝胶检测卡交叉配血外, 还需用凝聚胺法进行交叉配血来共同参考配血结果.

目的 探讨环指蛋白43(RNF43)对类风湿关节炎-滑膜成纤维细胞(RA-FLS)分泌MMPs的影响.方法 取膝关节置换术的RA患者滑膜组织,酶消法体外培养RA-FLS,构建RNF43慢病毒过表达质粒,转染后利用实时荧光定量(qRT)-PCR检测转染效率.转染成功后提取细胞RNA及培养液上清,分别通过qRT-PCR、ELISA检测MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA及蛋白表达情况.采用独立样本t检验进行统计分析.结果 当感染复数40时并加用聚凝胺可满足实验要求,RNF43的mRNA较空病毒对照组升高26 158倍.与空病毒对照组相比,RNF43过表达组MMP-1、MMP-3、MMP-13的mRNA[(0.19±0.06),t=28.314,P＜0.05;(0.28±0.07),t=23.413,P＜0.05;(0.21±0.09),t=18.365,P＜0.05]及蛋白[(31.0±9.4) pg/ml,(17.1±2.1) pg/ml,t=3.198,P=0.029]、MMP-3 [(38.7±8.1) pg/ml,(24.9±3.5) pg/ml,t=3.514,P=0.015]、MMP-13[(31.0±5.4)pg/ml,(20.6±2.9) pg/ml,t=5.632,P=-0.001]均明显减少.结论 RNF43可能通过抑制Wnt信号通路活性对RA-FLS分泌MMPs起抑制作用.

目的 制备高滴度慢病毒载体并探讨不同感染方式T细胞及其亚群的感染能力.方法 使用有限稀释的慢病毒感染HT1080细胞,流式细胞术检测细胞感染率,建立慢病毒滴度检测方法.比较不同转染试剂(磷酸钙、PEI、PEI-pro、Xfect纳米颗粒)瞬时转染293T细胞制备的慢病毒载体滴度.使用制备的高滴度慢病毒直接感染T细胞或使用Polybrene和Retronectin促进慢病毒感染T细胞,流式细胞术检测T细胞及其亚群的感染率.结果 建立了流式细胞术检测慢病毒滴度的方法.4种转染方法中使用Xfect纳米颗粒制备的慢病毒滴度最高.慢病毒直接感染和加入Polybrene促进感染T细胞感染率均可达50％以上,未观察到Polybrene明显促进T细胞感染作用.高滴度慢病毒对各分化阶段T细胞亚群的感染率均在50％以上.结论 成功制备高滴度慢病毒载体,且对T细胞各亚群感染能力无明显差异.本研究为慢病毒感染定向分化T细胞亚群的细胞回输治疗提供了研究基础.