目的:探讨尼克酰胺(NIC)在人胚胎干细胞(hESCs)诱导分化为神经嵴细胞过程中的作用，为hESCs进一步分化为角膜内皮细胞提供实验基础。方法:取培养5~7 d的hESCs细胞系H1进行诱导，根据诱导培养基中干预组分的不同分为未添加NIC组(仅使用诱导培养基)、NIC添加组(含10 mmol/L NIC的诱导培养基)、NIC+白藜芦醇(Res)组(含10 mmol/L NIC、10 μmol/L Res的诱导培养基)和Sirtinol组(含10 μmol/L Sirtinol的诱导培养基)，其中Res和Sirtinol分别为SIRT1活性激动剂和抑制剂，各组连续诱导7 d。采用实时荧光定量PCR法检测诱导1、3、5、7 d hESCs及神经嵴细胞标志物mRNA相对表达量；诱导后7 d，采用免疫荧光染色法测定hESCs来源神经嵴细胞相关标志蛋白的表达，采用流式细胞术分析hESCs来源神经嵴细胞表面标志物神经生长因子受体(P75)和人自然杀伤因子1(HNK-1)阳性细胞比率，以评价NIC诱导效率及调控SIRT1对HNK-1表达的影响。结果:与未添加NIC组相比，NIC添加组处理5 d后全能性基因八聚体结合转录因子4(OCT4)和同源域蛋白(NANOG) mRNA相对表达量显著降低，神经嵴细胞标志物P75、HNK-1、SRY相关HMG盒9(SOX9)和SOX10 mRNA相对表达量显著升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。免疫荧光染色结果显示，未添加NIC组神经嵴细胞标志物P75表达较弱，HNK-1仅有零星表达，转录因子激活蛋白2β(AP-2β)及成对样同源域转录因子2(PITX2)均未见阳性着色；NIC添加组细胞中P75、HNK-1、AP-2β及PITX2均呈广泛的强阳性表达。NIC添加组P75 +HNK-1 +和P75 +细胞比率明显高于未添加NIC组，差异均有统计学意义( t＝8.481， P＝0.001； t＝2.987， P＝0.041)。未添加NIC组、NIC添加组、NIC+Res组和Sirtinol组HNK-1 +细胞比率分别为(34.267±12.522)%、(89.633±1.358)%、(64.667±6.429)%和(86.300±3.460)%，总体比较差异有统计学意义( F＝36.799， P<0.001)，其中，NIC+Res组HNK-1 +细胞比率均明显低于NIC添加组和Sirtinol组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:NIC可通过抑制SIRT1的活性促进HNK-1表达，提高hESCs来源神经嵴细胞的分化效率，为神经嵴细胞相关疾病的治疗，如角膜内皮移植提供新的种子细胞来源。

目的 探讨骨形态发生蛋白9(BMP9)对肝细胞癌(HCC)肿瘤干细胞(CSCs)干性、增殖和侵袭的影响及机制.方法 取对数生长期的正常肝细胞、肝癌细胞、肝癌CSCs,采用RT-qPCR 法检测BMP9 mRNA表达,采用Western blotting法检测BMP9蛋白表达.采用慢病毒干扰载体转染肝细胞癌肿瘤干细胞(HepG2-CSCs)以敲低BMP9表达,并分成HepG2-CSCs 组、HepG2-CSCs-BMP9 敲低组.加入MAPK/ERK 信号激动剂(DIPQUO)后,将细胞分为三组:HepG2-CSCs组、HepG2-CSCs敲低组及HepG2-CSCs敲低+ DIPQUO组.采用RT-qPCR实验检测HepG2-CSCs 干性相关分子CD44、SOX2和OCT4表达,采用CCK-8实验检测细胞增殖能力,采用Transwell 实验检测细胞侵袭能力,采用蛋白印迹法检测MAPK/ERK 通路关键蛋白表达.结果 与正常肝细胞比,肝癌细胞和肝癌肿瘤干细胞(HepG2-CSCs)中BMP9表达上调(P<0.05).HepG2 CSCs 细胞中BMP9 mRNA 和蛋白表达高于HepG2 细胞(P均<0.05).BMP9 敲低后,HepG2-CSCs-BMP9 敲低组中HepG2-CSCs细胞中干细胞相关标志物CD44、SOX2、OCT4 mRNA表达较HepG2-CSCs 组降低(P均<0.05).与HepG2-CSCs 组比较,HepG2-CSCs-BMP9 敲低组中HepG2-CSCs 在48、72和96 h的细胞增殖能力降低(P均<0.05),HepG2-CSCs 细胞迁移和侵袭能力降低(P均<0.05).较HepG2-CSCs 组,HepG2-CSCs-BMP9 敲低组中HepG2-CSCs 中p-ERK1/2和 p-MEK1/2蛋白表达显著降低(P均<0.05).HepG2-CSCs敲低+ DIPQUO组HepG2-CSCs 中干细胞相关标志物CD44、SOX2、OCT4 mRNA表达增加(P均<0.05),HepG2-CSCs增殖和侵袭能力增强(P均<0.05).结论 BMP9 敲低可抑制 HepG2-CSCs干性维持并抑制细胞增殖、降低侵袭能力,机制可能与抑制 MAPK/ERK信号通路有关.

目的 探讨富血小板血浆细胞(PRP)与Y染色体上的性别决定基因区域(SOX9)受体激动剂对缓解SD大鼠膝骨关节炎综合征(KOA)的影响.方法 实验自2021年4月至2022年3月,体外用脂多糖(LPS)诱导SD大鼠关节软骨细胞炎症模型,用不同浓度的PRP与SOX9激动剂干预经LPS处理后的SD大鼠软骨细胞,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)与实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测相关疾病的mRNA表达水平.体内注射实验通过在局部麻醉作用下假手术离断SD大鼠的前交叉韧带而建立了KOA模型,分为实验组(10只)、对照组(10只)和假手术组大鼠(10只),采用苏木精-伊红(HE)染色、番红固绿染色及双甲苯胺蓝染色均显示无病理损伤,采用免疫组化染色检测软骨中基质金属蛋白酶-13(MMP-13)和低聚蛋白多糖酶-4(AD-AMTS-4).结果 体外实验,ELISA法结果显示,与正常组比较,在LPS的影响下白细胞介素(IL)-1β(81.65±1.37比58.3±2.26)、IL-6(73.3±1.75比34.75±1.75)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)(22.76±0.37比13.41±0.23)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)(1.06±0.01比0.84±0.02)浓度明显上升,加入不同浓度的PRP后各炎症因子均明显下降(P<0.05),在加入SOX9激动剂后各炎症因子下降更明显(64.29±1.87、47.01±1.75、19.24±0.16、0.92±0.01)(均P<0.01);RT-PCR结果显示,在LPS的影响下MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5、IL-1β、IL-6、环氧化酶-2抑制剂(COX-2)的mRNA表达上升,而软骨蛋白聚糖抗体(ACAN)和Ⅱ型多肽胶原酶(COL2A1)的表达量明显下降(均P<0.05),在加入不同浓度的PRP和SOX9激动剂后在各指标均得到明显恢复,其中以SOX9激动剂影响下最为明显(均P<0.01).体内病理实验,通过膝关节软骨大体观检查和关节病理组织切片及染色等结果的显示,实验组关节软骨的局部病理软组织损伤及程度可较对照组明显减轻.结论 富血小板血浆可能会通过调控SOX9受体的表达,减少高聚蛋白多糖的丢失和抑制软骨细胞肥大因子及软骨细胞基质中的Ⅱ型胶原质的诱导降解,并还能直接有效地抑制由于LPS所致软骨的各种炎症因子蛋白的异常表达生成和诱导释放,从而可减少对软骨细胞的外源基质因子的诱导降解,达到缓解骨关节炎病程发展的目的.

背景:沉默信息调节因子1(sirtuin type 1, Sirt1)基因与骨关节炎有密切联系,但其具体作用机制尚不明确.目的:探讨Sirt1基因对软骨细胞胞外基质的影响及其具体的表现形式.方法:体外分离并培养小鼠的膝关节软骨细胞,通过甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色等方法鉴定软骨细胞.根据实验设计加入不同的作用物质而将实验分为3组:空白对照组,EX-527组(Sirt1基因的抑制剂,终浓度为1 mmol/L)和白藜芦醇组(Sirt1基因的激动剂,终浓度为100 μmol/L).RT-PCR检测Sirt1基因,软骨细胞外基质特异性合成基因Sox9、Ⅱ型胶原蛋白和聚蛋白多糖及软骨细胞外基质特异性降解基因MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的mRNA表达水平.结果:免疫荧光染色检测显示,Ⅱ型胶原染色阳性细胞数占90%以上,表明培养细胞为软骨细胞.与空白对照组比较,白藜芦醇组中Sirt1基因mRNA表达明显上调,Sox9、聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原的mRNA表达显著增加,MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的mRNA表达显著减少(P<0.05);EX-527组中Sirt1基因mRNA表达明显下降,Sox9、聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原的mRNA表达显著减少,MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的mRNA表达显著增加(P<0.05).结论:Sirt1基因能够对软骨细胞胞外基质产生影响,且Sirt1的表达可以促进软骨细胞胞外基质的合成并且减缓软骨细胞胞外基质的降解.

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)β/δ激动剂(GW0742)对人关节液来源的间充质干细胞(hSF-M SC)成软骨分化及炎性环境下炎症因子释放的影响.方法 抽取膝关节骨关节炎患者患侧关节腔内的关节液并分离培养及鉴定.设置空白对照组(不完全成软骨诱导培养基)、转化生长因子(TGF)-β1组(含浓度为10 ng/mL TGF-β1的成软骨诱导培养基)、TGF-β1+GW0742组(含10 ng/mL TGF-β1、1μmol/L GW0742的成软骨诱导培养基)及GW0742组(含浓度为1μmol/L GW0742的成软骨诱导培养基),采用Pellet法诱导hSF-MSC成软骨分化.通过比较各组成软骨分化相关标志物SOX-9基因表达和蛋白合成以及阿利新蓝、甲苯胺蓝染色等来评估GW0742对hSF-MSC增殖及成软骨分化能力的影响.另设置空白对照组(20％ 关节液+80％ 完全培养基)、hSF-MSC组(20％ 关节液+80％ 完全培养基+1×105个/mL hSF-MSC)、hSF-MSC+GW0742组(20％ 关节液+80％ 完全培养基+1μmol/L GW0742+1×105个/mL hSF-MSC),通过比较第1、3天各组培养液中炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α表达来评估GW0742+hSF-MSC组免疫抑制能力.结果 应用直接贴壁法成功从炎性关节液中分离培养hSF-MSC.TGF-β1、TGF-β1+GW0742及GW0742对hSF-MSC增殖能力无明显影响;聚合酶链反应(PCR)和Western Blot检测表明,GW0742组hSF-MSC成软骨分化作用最为明显;甲苯胺蓝和阿利新蓝染色显示,GW0742组hSF-MSC能分泌较多的蛋白聚糖,且较TGF-β1+GW0742组细胞分泌的蛋白聚糖更为致密;hSF-MSC+GW0742组炎症因子表达显著低于hSF-MSC组.结论 PPARβ/δ激动剂GW0742不仅能提升hSF-MSC成软骨分化能力,还能增强hSF-MSC抗炎能力.

目的:基于机械敏感离子通道探讨牛蒡子苷元(ARG)对软骨细胞SRY相关高迁移率族盒蛋白转录因子9(SOX9)、Runt相关转录因子2(RUNX2)和胶原蛋白表达的影响.方法:分离并培养原代小鼠软骨细胞.将细胞分为空白组(常规培养基)、ARG组(10 μnol/L)、瞬时受体电位香草素亚家族4(TRPV4)抑制剂组(GSK2193874,10 nmol/L)、ARG+抑制剂组(10 μmol/L ARG+ 10 nmol/L GSK2193874)和TRPV4激动剂组(GSK1016790A,10 nmol/L),各组给予相应干预.细胞培养24h后,免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白(Col Ⅱ)表达,PCR检测Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ)和ColⅡ的mRNA表达水平,Western blot检测转录因子SOX9、RUNX2及ColⅠ、ColⅡ的蛋白表达水平.结果:①免疫荧光染色观察显示,与空白组相比,ARG组、抑制剂组和ARG+抑制剂组Col Ⅱ蛋白表达更显著,而激动剂组较弱.与ARG组或抑制剂组相比,ARG+抑制剂组Col Ⅱ蛋白表达更显著.②与空白组相比,ARG组、抑制剂组和ARG+抑制剂组Col Ⅱ mRNA表达量显著增高(P＜0.05,P＜0.01),Col Ⅰ mRNA表达量明显降低(P＜0.01),而激动剂组Col Ⅱ mRNA表达量显著降低(P＜0.01).与ARG组相比,抑制剂组和ARG+抑制剂组细胞的Col Ⅱ和Col Ⅰ的mRNA表达量均显著增高(P＜0.05,P＜0.01),而激动剂组Col Ⅰ mRNA表达量增高(P＜0.01),Col Ⅱ mRNA表达量降低(P＜0.01).与抑制剂组相比,ARG+抑制剂组Col Ⅱ和Col Ⅰ的mRNA表达量均显著增高(P＜0.05).③与空白组相比,ARG组Col Ⅱ蛋白表达量显著上调(P＜0.01),Col Ⅰ、SOX9和RUNX2蛋白表达量降低(P＜0.05,P＜0.01);抑制剂组Col Ⅱ蛋白表达量亦明显增多(P＜0.01),Cd Ⅰ和RUNX2蛋白表达量明显降低(P＜0.01);ARG+抑制剂组细胞的Col Ⅱ蛋白表达量显著升高(P＜0.01),SOX9蛋白表达量显著降低(P＜0.05),Col Ⅰ和RUNX2蛋白表达无明显变化(P＞0.05);激动剂组Col Ⅱ和SOX9蛋白表达量明显降低(P＜0.01),RUNX2蛋白表达量明显增高(P＜0.01),Col Ⅰ蛋白表达量无明显变化(P＞0.05).④与ARG组相比,抑制剂组ColⅡ和Col Ⅰ蛋白表达量均显著增高(P＜0.05,P＜0.01);ARG+抑制剂组细胞的ColⅡ、CoiⅠ和RUNX2蛋白表达量均明显增高(P＜0.01);激动剂组Col Ⅱ蛋白表达量降低(P＜0.01),CoiⅠ和RUNX2蛋白表达量升高(P＜0.01).与抑制剂组相比,ARG+抑制剂组细胞的Col Ⅱ、Col Ⅰ和RUNX2蛋白表达量均显著增多(P＜0.05),SOX9蛋白表达量明显降低(P＜0.05).结论:ARG可上调软骨细胞Col Ⅱ表达,抑制Col Ⅰ表达,调节转录因子SOX9和RUNX2,促进软骨细胞分化成熟.其作用与TRPV4抑制剂相似,两者合用对Col Ⅱ的调控作用更显著.

目的 探讨miR-375靶向锌指蛋白470(ZNF470)对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成软骨分化的调控作用.方法 以诱导成软骨分化培养基诱导hPDLSCs成软骨分化,实时荧光定量PCR法检测成软骨分化诱导1、3、7、14、21 d时miR-375及ZNF470 mRNA的表达,双荧光素酶报告基因检测法分析miR-375与ZNF470的靶向调控关系.将hPDLSCs分为空白对照组、阴性对照组、miR-375过表达组、对照+空载组、miR-375过表达+空载组及miR-375过表达+ZNF470组,分别转染对照激动剂(NC-ago)、miR-375突变激动剂(miR-375-mut-ago)、miR-375激动剂(miR-375-ago)、NC-ago+空载、miR-375-ago+空载以及miR-375-ago+ZNF470载体,转染后对各组细胞进行成软骨分化诱导.采用阿尔新蓝染色观察各组成软骨分化情况,实时荧光定量PCR与Western blotting分别检测软骨标志性基因Ⅱ型胶原α1(COL2A1)、性别决定基因9(SOX9)、软骨可聚蛋白多糖(ACAN)以及透明质酸合酶2(HAS2)的mRNA与蛋白表达水平.结果 诱导hPDLSCs成软骨分化过程中miR-375 mRNA表达呈时间依赖性下调,ZNF470 mRNA表达呈时间依赖性上调,miR-375与ZNF470表达呈负相关(r=-0.47,P<0.05).双荧光素酶报告基因显示,miR-375可靶向负调控ZNF470.阿尔新蓝染色显示,成软骨分化程度miR-375过表达组<空白对照组、阴性对照组,miR-375过表达+空载组

背景:表皮生长因子受体是调节细胞周期的关键因子,其介导的细胞下游信号通路广泛参与调控细胞的多种生物学过程,然而该信号通路对小鼠关节软骨表层细胞的增殖、分化及凋亡的影响有待进一步研究.目的:分离并培养小鼠关节软骨表层细胞,验证表皮生长因子受体信号通路对小鼠关节软骨表层细胞的增殖、分化及凋亡的影响.方法:通过纤连蛋白黏附及酶消化法体外分离培养小鼠关节软骨表层细胞并鉴定;取P3细胞分别给予表皮生长因子受体信号通路激动剂转化生长因子α100μg/L与抑制剂Gefitinib 10μmol/L,常规培养基为对照组.通过CCK-8法检测细胞增殖情况同时利用实时荧光定量检测增殖相关基因Ki67的mRNA表达水平;肿瘤坏死因子α(25μg/L)诱导细胞凋亡,AOEB染色鉴定凋亡情况,实时荧光定量PCR检测抑制凋亡基因Bcl-2与促进凋亡基因Bax的mRNA表达水平;对各组细胞进行成软骨、成骨、成脂连续诱导14-21 d,利用实时荧光定量PCR检测软骨相关基因Sox9、成骨相关基因Runx2、脂肪相关基因脂蛋白脂肪酶的mRNA表达水平.结果 与结论:①体外分离培养小鼠关节软骨表层细胞,形态偏长,免疫荧光鉴定阳性表达Prg4;②CCK-8检测结果提示转化生长因子α组细胞增殖能力明显增强,而Ki67 mRNA表达水平显著升高(P<0.05);③AOEB染色结果提示转化生长因子α组细胞凋亡水平降低,Bcl-2 mRNA表达水平显著升高,Bax mRNA表达水平显著降低(P<0.05);④诱导三系分化实时荧光定量PCR结果显示,转化生长因子α组Runx2 mRNA表达水平显著升高(P<0.05),而Sox9的mRNA表达水平显著降低(P<0.05);⑤结果表明,表皮生长因子受体信号通路参与关节软骨表层细胞的增殖、分化及凋亡,转化生长因子α介导表皮生长因子受体促进关节软骨表层细胞增殖及成骨分化,抑制其向成软骨分化及凋亡.