SpyTagr和SpyCatche可通过自发反应形成共价键,产生稳定的分子自组装体.酶分子自组装体因具有高效有序的催化特性在合成生物学和纳米技术领域具有重要的应用价值.为探索SpyTag/SpyCatcher在大肠杆菌胞内多酶复合体系形成有序自组装分子能力,将SpyTagr和SpyCatche分别与P450BM3m单加氧酶和葡萄糖脱氢酶GDH进行融合表达,以期产生具有辅酶再生循环系统、高效生物合成靛蓝分子的SpyTag/SpyCatcher双酶自组装复合体.首先,通过电泳及质谱对重组工程茵表达蛋白进行分析,证实SpyCatcher-P450BM3m与SpyTag-GDH在胞内成功形成了自组装多酶复合体;然后,系统分析不同培养条件下组装体合成靛蓝的能力.结果发现,经0.5mmol/L IPTG诱导后,菌体在16℃继续培养18h后,工程菌对吲哚(2mmol/L)与葡萄糖(4mmol/L)的全细胞催化能力最强,靛蓝产量最高达258mg/L,是未组装多酶系统的1.9倍,比P450BM3m单酶表达系统高约2.4倍;反应70min后达到反应平衡,转化率为52％.成功实现了SpyTag/SpyCatcher介导的多酶体系在大肠杆菌细胞中的自组装和高效转化体系,为胞内多酶复合物组装体的设计提供了新思路.

类弹性蛋白(elastin-like polypeptides,ELPs)属于弹性蛋白质中的一种,且具有温控性的生物大分子,本文研究拥挤试剂对不同拓扑结构ELPs相变温度的影响,利用温控-紫外分光光度计研究其相变特性,结果发现,随着PEG2000浓度的增加,T-E-F(three-armed ELPs-Foldon的简称)的相变温度下降11.9～17.1℃;在固定Tadpole-like-E(Tadpole-like-ELPs的简称)浓度下,随着PEG2000浓度的增加,Tadpole-like-E的相变温度降低11.5 ～16℃,其中,25 μmol/L的Tadpole-like-E其相变速度缓慢;ELPs浓度越大,其相变温度降低愈大,且PEG2000影响ELPs相变温度的趋势与ELPs的拓扑结构关系不大.另外,在PBS缓冲溶液中加入PEG2000,可以使E-C(ELPs-SpyCather的简称)在浓度＜0.5 mol/L的Na2CO3中发生相变,且随着PEG2000浓度的增加,E-C相变温度逐渐降低.本研究为今后ELPs在复杂体系的应用提供前期的基础研究.

异肽键分子粘合剂是多肽链中的赖氨酸 (Lys) 残基和天冬酰胺或天冬氨酸 (Asn/Asp) 残基侧链自发结合形成的不可逆共价键, 具有良好的特异性和稳定性.该反应可在极短的时间完成, 且不需要特定的理化环境和催化剂.文中结合近年来国内外学者对异肽键分子粘合剂的研究进展, 综述了异肽键分子粘合剂的来源、类型、形成机制及其介导的分子环化和蛋白拓扑结构, 并讨论了其在合成疫苗、水凝胶和细菌纳米生物反应器等领域的应用前景.

在高温下保持催化活性是工业酶的重要性质.近年来,采用基因工程、蛋白质工程技术提高野生酶进行催化活性或耐热等性质取得了重要进展.文中利用新近建立起来的异肽键介导的SpyTag/SpyCatcher系统对瘤胃微生物来源的木聚糖酶XYN11-6进行分子环化,获得稳定的环化酶C-XYN11-6.在60℃、70℃和80℃下处理10 min,C-XYN11-6的残余活性为81.53％、73.98％和64.41％,分别是相同条件下线性蛋白L-XYN11-6残余活性的1.48、2.92、3.98倍.经60-90℃热处理10 min后,C-XYN11-6仍保持可溶状态,而L-XYN11-6几乎完全聚沉.内源荧光和8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)结合荧光光谱分析显示,较之L-XYN11-6,热处理环境中C-XYN11-6更能够维持其构象稳定.值得注意的是,分子环化提高了C-XYN11-6对0.1-50 mmol/L Ca2+或0.1 mmol/L Cu2+的耐受能力.综上所述,文中利用SpyTag/SpyCatcher系统获得热稳定性和离子稳定性提高的环化酶,为工业酶的分子改良及扩大其在工业领域的应用建立了良好基础.

Due to the complexity of bioactive ingredients in biological samples,the screening of target proteins is a complex process.Herein,a feasible strategy for directing protein immobilization on silica magnetic beads for ligand fishing based on SpyTag/SpyCatcher(ST/SC)-mediated anchoring is presented.Carboxyl functional groups on the surface of silica-coated magnetic beads(SMBs)were coupled with SC using the 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride/N-hydroxysulfosuccinimide method,named SC-SMBs.The green fluorescent protein(GFP),as the capturing protein model,was ST-labeled and anchored at a specific orientation onto the surface of SC-SMBs directly from relevant cell lysates via ST/SC self-ligation.The characteristics of the SC-SMBs were studied via electron microscopy,energy dispersive spectroscopy,and Fourier transform infrared spectroscopy.The spontaneity and site-specificity of this unique reaction were confirmed via electrophoresis and fluorescence analyses.Although the alkaline stability of ST-GFP-ligated SC-SMBs was not ideal,the formed isopeptide bond was unbreakable under acidic conditions(0.05 M glycine-HCl buffer,pH 1-6)for 2 h,under 20％ethanol solution within 7 days,and at most temperatures.We,therefore,present a simple and universal strategy for the preparation of diverse protein-functionalized SMBs for ligand fishing,prompting its usage on drug screening and target finding.

目的 基于分步偶联策略,借助经典的马来酰亚胺-巯基交联反应与异肽键分子黏合方法(SpyTag/Spy-Catcher系统),建立抗原与CpG佐剂的定点共价结合技术.方法 设计合成马来酰亚胺修饰的CpG-1018和N端加有半胱氨酸的SpyTag短肽,将二者于20℃振荡孵育以获得中间产物SpyTag-CpG.将SpyCatcher与蛋白抗原Omp19融合表达,通过亲和层析及凝胶过滤层析获得SpyCatcher-Omp19重组蛋白.通过本实验室构建的志贺菌多糖抗原SpyCatcher-OPS糖蛋白表达系统,获得SpyCatcher-OPS糖蛋白.将SpyTag-CpG分别与SpyCatcher-Omp19重组蛋白和SpyCatcher-OPS糖蛋白连接,获得CpG佐剂与抗原共价偶联终产物CpG-Omp19和CpG-OPS,经SDS-PAGE分离后,通过荧光分析验证终产物结构.结果 马来酰亚胺和FAM同时标记的CpG-1018和SpyTag连接后,SDS-PAGE检测结果可见对应于SpyTag-CpG交联产物的高相对分子质量条带.马来酰亚胺修饰的CpG-1018与SpyTag连接后,质谱分析结果显示,SpyTag-CpG的相对分子质量与其理论相对分子质量相符合.将中间产物SpyTag-CpG与蛋白抗原SpyCatcher-Omp19、多糖抗原SpyCatcher-OPS孵育连接后,考马斯亮蓝染色和FAM荧光检测均可见对应于终产物CpG-Omp19和CpG-OPS的高相对分子质量条带.结论 成功建立基于分步偶联策略的抗原与CpG佐剂定点共价结合技术,获得了CpG佐剂与两种不同类型抗原的偶联终产物CpG-Omp19和CpG-OPS,为未来开发质量可控的自佐剂疫苗奠定了基础.

生物活材料的研究主要集中在利用单一细菌生产生物膜、水塑料等体外应用.由于菌株尺寸较小,当其应用于体内时,容易发生逃逸,导致滞留效果较差.为解决这一难题,本研究借助大肠杆菌(Escherichiacoli)表面展示系统(Neae),在两个菌株表面分别展示SpyTag和SpyCatcher,构建一种双菌"锁扣"型生物活材料生产系统.两菌株之间通过SpyTag和SpyCatcher的结合,发生原位交联,从而长时间滞留在肠道部位.体外实验表明两菌株混合几分钟后,会发生明显的沉降.此外,利用共聚焦成像和微流控平台进一步证明了该系统在流动状态下的粘附效果.最后,为了验证该系统在体内应用的可行性,小鼠连续3 d 口服A菌(p15A-Neae-SpyTag/sfGFP)和B菌(p 15A-Neae-SpyCatcher/mCherry),收集肠道组织进行冷冻切片染色.结果表明,相较于未结合菌株,该双菌系统能更多滞留在小鼠肠道,为生物活材料进一步的体内应用奠定了基础.