为了解SpyCatcher-ELPs40 (C-E) 相变异常的原因并考察寡聚化结构域对其相变行为的影响, 将Foldon (F) 分别与C-E和ELPs40 (E) 融合, 构建拓扑结构为非共价三臂星型寡聚化的C-E-F和E-F;探究不同盐浓度和类型对其相变特性的影响, 并与其他ELPs进行比较.结果显示:融合了Foldon的ELPs40的相变温度高于线型ELPs120而低于线型ELPs40及Spy Tag/Spy Catcher介导的共价三臂星型ELPs, 非共价三臂星型C-E-F的相变温度变化幅度较大, 与等重复数的C-E和ELPs40相比, 平均分别高出28.75℃和35.6℃, 尤其在NaCl浓度为0.8 mol/L时, 相差分别为41.2℃和47.1℃.同时, Na2CO3浓度在0.7 mol/L及以上时, 非共价三臂星型C-E-F才会在低温下发生相变, 而其在较低浓度的Na2SO4溶液中相变现象明显, 不符合Hofmeister效应.本研究报道了非线型ELPs特殊的相变行为, 并证明ELPs拓扑结构会影响其相变行为, 但Foldon和Spy Catcher表面电荷是更重要的因素.

类弹性蛋白多肽(ELP)为含有人工合成的ELP60基因的表达载体pRELPN,能促使外源基因在大肠杆菌中的高表达.当ELP60在大肠杆菌表达载体pET28a的多克隆位点被克隆后,其自身的表达低,也不与目的基因构成ELP融合蛋白质,而是促进克隆在ELP60基因后的含起始密码ATG的外源目的基因独立高表达.外源目的基因表达量占宿主蛋白的20％～60％,比用pET28a载体表达的外源基因表达量高2～10倍.此类表达载体pRELPN适合于表达包括抗体、抗原、酶、重组蛋白质、多肽及ELP融合蛋白质等的外源基因的独立高表达.这些结果表明,pRELPN代表了一种有效的表达载体,有助于解决在原核表达中,所受限的普通载体对外源基因低表达或不表达所导致的不能产业化的问题.

类弹性蛋白(elastin-like polypeptides,ELPs)属于弹性蛋白质中的一种,且具有温控性的生物大分子,本文研究拥挤试剂对不同拓扑结构ELPs相变温度的影响,利用温控-紫外分光光度计研究其相变特性,结果发现,随着PEG2000浓度的增加,T-E-F(three-armed ELPs-Foldon的简称)的相变温度下降11.9～17.1℃;在固定Tadpole-like-E(Tadpole-like-ELPs的简称)浓度下,随着PEG2000浓度的增加,Tadpole-like-E的相变温度降低11.5 ～16℃,其中,25 μmol/L的Tadpole-like-E其相变速度缓慢;ELPs浓度越大,其相变温度降低愈大,且PEG2000影响ELPs相变温度的趋势与ELPs的拓扑结构关系不大.另外,在PBS缓冲溶液中加入PEG2000,可以使E-C(ELPs-SpyCather的简称)在浓度＜0.5 mol/L的Na2CO3中发生相变,且随着PEG2000浓度的增加,E-C相变温度逐渐降低.本研究为今后ELPs在复杂体系的应用提供前期的基础研究.

温敏类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELPs)作为新型的药物载体,在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景.本研究根据大肠杆菌密码子的偏好性和简并性,将高度连续重复氨基酸的多种遗传密码引入基因序列中,利用依次插入单体基因和递归定向连接技术,成功构建了以缬氨酸为客座氨基酸的ELPs基因的表达质粒库,即pET28-ELP-V5～pET28-ELP-V50.将pET28-V50转化至表达宿主Escherichia coli BL21 (DE3)中,经重组菌的培养和IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示ELP-V50在大肠杆菌中成功获得了可溶性表达,与预期分子量大小一致.本研究为进一步构建不同分子量的ELPs基因库提供了新的思路,并为重组表达获得特定相变特性的多肽分子奠定了基础.

背景 近距离放射治疗是治疗癌症的靶向放射疗法,类弹性蛋白多肽(elastin-like peptide,ELP)是一种人工合成的弹性蛋白,其具有的自组装性、温度响应性和非免疫原性等独特优势,为其成为放射性核素131I的载体提供了可能.目的 制备放射性核素131I标记的ELP,研究不同放射性浓度131I-ELp对兔VX2肝癌模型近距离放射治疗的有效性及差异性,为其临床应用提供依据.方法 应用Iodogen法对ELP进行131I碘化标记,制备100 mCi/mL和50 mCi/mL放射浓度的131I-ELP;在B超引导下将不同浓度131I-ELP药物及ELP溶液随机注入15只VX2模型兔的肝肿瘤内进行近距离放射性治疗及空白对照观察,以注入100 mCi/mL 131I-ELP为高放射浓度治疗组(H组,n=5);注入50 mCi/mL 131I-ELP为低放射浓度治疗组(L组,n=5)及注入ELP溶液为空白对照组(C组,n=5).治疗后,定期行B超及血液学检查以观察治疗效果,治疗组行单光子发射计算机断层扫描/计算机断层扫描(single-photon emission computed tomography/computed tomography,SPECT/CT)检查,观察三组动物的自然生存时间和病理学检查.结果 H组的动物生存期最长(61.4 d±10.50 d),L组的动物生存期为(52.6 d±8.85 d),C组的动物生存期最短(39.2 d±5.63 d),三组之间有显著差异(P＜0.05).治疗后7d、14d,SPECT/CT示治疗组的放射性持续位于肿瘤内部.H和L组的肿瘤生长率显著低于C组(P＜0.05).H和L组治疗后7d、14 d肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)显著低于C组(P＜0.05),治疗后7dL组的ALT水平显著低于H组(P＜0.05);治疗后14d,L组AST数值显著低于H组(P＜0.05),提示H组的肝功能受损更严重.治疗后7d、14 d三-组Hb、RBC计数无显著差异.病理组织学检查示H组癌旁正常肝组织存在小叶中央静脉淤血、肝窦及汇管区小胆管扩张、肝内纤维增生,在肿瘤组织内发现大片状坏死.L组的癌旁正常组织则仅见少量纤维增生.结论 131I-ELP近距离放射疗法可杀伤肝癌细胞,放射性浓度为100 mCi/mL的131I-ELP较50 mCi/mL的杀伤作用更强,但其放射性损伤也更大.

目的 构建类弹性蛋白多肽(ELPs)的表达质粒并获得类弹性蛋白多肽.方法 构建含ELPs的原核表达载体,转化E.coli BL21感受态细胞,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导ELPs蛋白表达并对其进行纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白纯度.结果 成功构建pET-28a-ELPs原核表达载体,在相对分子质量55 000处出现目的条带,与目的蛋白分子量大小一致,蛋白纯度为95％.结论 成功表达并纯化出ELPs蛋白,为ELPs在组织工程方面的应用奠定了基础.

目的 探讨含RGD肽的类弹性蛋白多肽RGD-ELPs和RDG-ELPs与细胞相容性及两种融合蛋白对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)黏附的影响.方法 应用大肠杆菌系统表达RGD-ELPs和RDG-ELPs蛋白,利用可逆相变循环(ITC)纯化两种融合蛋白;通过MTT法及活/死细胞染色法检测两种融合蛋白与人胚肾细胞(HEK293T)的相容性;通过贴壁细胞计数方法检测不同浓度RGD-ELP对体外HUVECs细胞黏附表达的影响.结果 利用BL21(DE3)大肠杆菌表达系统制备高浓度的RGD-ELPs和RDG-ELPs,通过ITC纯化得到了高纯度融合蛋白;MTT法及活/死细胞染色法结果提示RGD-ELPs和RDG-ELPs蛋白具有良好的相容性;细胞黏附实验结果表明:RGD-ELPs浓度越大,HUVEC细胞黏附能力越强,而对照组RDG-ELPs则未显示出明显的细胞黏附效果.结论 成功表达并纯化了RGD-ELPs和RDG-ELPs融合蛋白;两种蛋白均具有良好的细胞相容性;RGD-ELPs蛋白具有明显的促进HUVECs细胞黏附作用.

了解外源酶对类弹性蛋白多肽(ELPs)相变温度及聚集所形成颗粒粒径大小及分布的规律,有助于高效利用非色谱纯化技术实现目标酶分离纯化,也为选择孔径合适的分离膜构建酶膜反应器提供依据.以ELPs40、寡聚化ELPs40(E-F)、寡聚化及线性的地衣多糖酶(B-E-F、B-E)和木聚糖酶(X-E-F、X-E)为研究对象,考察外源酶对ELPs40相变温度的影响.结果显示,引入地衣多糖酶及木聚糖酶分别将ELPs的相变温度提高了11 ℃和13 ℃;而寡聚化结构域Foldon却使B-E-F及X-E-F相变温度分别降低了8℃和11℃.此外,探究了NaCI、Na2SO4及Na2CO3对上述融合蛋白中ELPs相变温度的影响.结果显示,B-E-F在0.1-0.3 mol/L Na2CO3溶液中未发生相变,而在等浓度的Na2SO4溶液中则发生了明显相变,这一现象明显不符合Hofmeister离子序,这可能与地衣多糖酶和Foldon较低的等电点有关.

目的 构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELP-mCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法 对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,构建重组质粒pET28a-ELP-mCherry;将重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中,诱导表达ELP-mCherry融合蛋白;利用可逆转变循环(ITC)法对ELP-mCherry融合蛋白进行纯化;通过MTT法探讨ELP-mCherry融合蛋白与人胚肾上皮细胞HEK293T和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的细胞相容性.结果 DNA测序结果 显示成功构建了ELP-mCherry原核表达载体;利用BL21(DE3)大肠杆菌表达系统成功表达ELP-mCherry融合蛋白,通过ITC法纯化得到了高纯度融合蛋白.MTT结果 表明:在所有ELP-mCherry蛋白测试浓度下,HEK293T和NIH3T3细胞存活率接近或超过100％.结论 成功构建ELP-mCherry原核表达载体,成功表达并纯化得到高纯度的ELP-mCherry融合蛋白,ELP-mCherry融合蛋白在HEK293T和NIH3T3细胞中具有良好的细胞相容性.

[目的]建立用于重组腺联病毒(AAV)纯化的受体结合捕捉方法.[方法]将AAV受体的多囊肾病(PKD)结构域1和2与类弹性蛋白多肽(ELP)在重组大肠杆菌中进行融合表达,利用相变循环(ITC)纯化ELP-PKD融合蛋白;分别用昆虫和AAV-293细胞制备rAAV-GFP,与ELP-PKD融合蛋白共孵育后进行ITC,从沉淀复合物提取病毒DNA进行PCR检测;在优化条件下利用ELP-PKD蛋白结合捕捉rAAV-GFP,利用电子显微镜观察、免疫转印和细胞感染试验进行rAAV鉴定.[结果]ELP-PKD融合蛋白获得正确、可溶性表达,ITC纯化的蛋白纯度大于90％;ELP-PKD蛋白能特异结合rAAV-GFP,结合具有pH、温度和时间依赖性,受体结合捕捉方法可在1h内完成,从两种细胞纯化rAAV-GFP的回收率分别为58％和56％;rAAV-GFP洗脱具有pH和温度依赖性,洗脱rAAV-GFP的回收率分别为46％和44％;纯化rAAV-GFP具有AAV的典型形态和结构蛋白.[结论]建立的ELP-PKD结合捕捉法可用于不同细胞源rAAV的快速纯化.