为了解SpyCatcher-ELPs40 (C-E) 相变异常的原因并考察寡聚化结构域对其相变行为的影响, 将Foldon (F) 分别与C-E和ELPs40 (E) 融合, 构建拓扑结构为非共价三臂星型寡聚化的C-E-F和E-F;探究不同盐浓度和类型对其相变特性的影响, 并与其他ELPs进行比较.结果显示:融合了Foldon的ELPs40的相变温度高于线型ELPs120而低于线型ELPs40及Spy Tag/Spy Catcher介导的共价三臂星型ELPs, 非共价三臂星型C-E-F的相变温度变化幅度较大, 与等重复数的C-E和ELPs40相比, 平均分别高出28.75℃和35.6℃, 尤其在NaCl浓度为0.8 mol/L时, 相差分别为41.2℃和47.1℃.同时, Na2CO3浓度在0.7 mol/L及以上时, 非共价三臂星型C-E-F才会在低温下发生相变, 而其在较低浓度的Na2SO4溶液中相变现象明显, 不符合Hofmeister效应.本研究报道了非线型ELPs特殊的相变行为, 并证明ELPs拓扑结构会影响其相变行为, 但Foldon和Spy Catcher表面电荷是更重要的因素.

类弹性蛋白(elastin-like polypeptides,ELPs)属于弹性蛋白质中的一种,且具有温控性的生物大分子,本文研究拥挤试剂对不同拓扑结构ELPs相变温度的影响,利用温控-紫外分光光度计研究其相变特性,结果发现,随着PEG2000浓度的增加,T-E-F(three-armed ELPs-Foldon的简称)的相变温度下降11.9～17.1℃;在固定Tadpole-like-E(Tadpole-like-ELPs的简称)浓度下,随着PEG2000浓度的增加,Tadpole-like-E的相变温度降低11.5 ～16℃,其中,25 μmol/L的Tadpole-like-E其相变速度缓慢;ELPs浓度越大,其相变温度降低愈大,且PEG2000影响ELPs相变温度的趋势与ELPs的拓扑结构关系不大.另外,在PBS缓冲溶液中加入PEG2000,可以使E-C(ELPs-SpyCather的简称)在浓度＜0.5 mol/L的Na2CO3中发生相变,且随着PEG2000浓度的增加,E-C相变温度逐渐降低.本研究为今后ELPs在复杂体系的应用提供前期的基础研究.

将foldon结构域与阿魏酸酯酶C-末端进行融合表达并用组氨酸标签对融合蛋白进行纯化.实现基于foldon的寡聚化阿魏酸酯酶及单体阿魏酸酯酶在毕赤酵母GSll5中表达,并应用目标蛋白与foldon结构域融合可自发形成三聚体结构的特性对阿魏酸酯酶进行改造,以提高阿魏酸酯酶的催化性能.经纯化获得寡聚化及单体阿魏酸酯酶,寡聚化阿魏酸酯酶表观分子量约为110 kDa,单体阿魏酸酯酶表观分子量为40 kDa;寡聚化阿魏酸酯酶的最适反应温度和pH分别为50℃和5.0,而单体阿魏酸酯酶则分别为50℃和6.0.寡聚化阿魏酸酯酶的底物亲和力(Km)及催化效率(kcat/Km)较单体阿魏酸酯酶分别提高3.42倍和7.57倍.结果 表明,寡聚化及单体阿魏酸酯酶均成功表达,且寡聚化阿魏酸酯酶在底物亲和力和催化效率上具有明显优势,该提高阿魏酸酯酶催化效率的方法简单、高效,有很好的应用前景.

了解外源酶对类弹性蛋白多肽(ELPs)相变温度及聚集所形成颗粒粒径大小及分布的规律,有助于高效利用非色谱纯化技术实现目标酶分离纯化,也为选择孔径合适的分离膜构建酶膜反应器提供依据.以ELPs40、寡聚化ELPs40(E-F)、寡聚化及线性的地衣多糖酶(B-E-F、B-E)和木聚糖酶(X-E-F、X-E)为研究对象,考察外源酶对ELPs40相变温度的影响.结果显示,引入地衣多糖酶及木聚糖酶分别将ELPs的相变温度提高了11 ℃和13 ℃;而寡聚化结构域Foldon却使B-E-F及X-E-F相变温度分别降低了8℃和11℃.此外,探究了NaCI、Na2SO4及Na2CO3对上述融合蛋白中ELPs相变温度的影响.结果显示,B-E-F在0.1-0.3 mol/L Na2CO3溶液中未发生相变,而在等浓度的Na2SO4溶液中则发生了明显相变,这一现象明显不符合Hofmeister离子序,这可能与地衣多糖酶和Foldon较低的等电点有关.