Lipid remodeling is crucial for cold tolerance in plants.However,the precise alternations of lipidomics during cold responses remain elusive,especially in maize(Zea mays L.).In addition,the key genes responsible for cold tolerance in maize lipid metabolism have not been identified.Here,we integrate lip-idomic,transcriptomic,and genetic analysis to determine the profile of lipid remodeling caused by cold stress.We find that the homeostasis of cellular lipid metabolism is essential for maintaining cold tolerance of maize.Also,we detect 210 lipid species belonging to 13 major classes,covering phospholipids,glyc-erides,glycolipids,and free fatty acids.Various lipid metabolites undergo specific and selective alterations in response to cold stress,especially mono-/di-unsaturated lysophosphatidic acid,lysophosphatidylcho-line,phosphatidylcholine,and phosphatidylinositol,as well as polyunsaturated phosphatidic acid,monogalactosyldiacylglycerol,diacylglycerol,and triacylglycerol.In addition,we identify a subset of key enzymes,including ketoacyl-acyl-carrier protein synthase Ⅱ(KAS Ⅱ),acyl-carrier protein 2(ACP2),male sterility33(Ms33),and stearoyl-acyl-carrier protein desaturase 2(SAD2)involved in glycerolipid biosynthetic pathways are positive regulators of maize cold tolerance.These results reveal a comprehensive lipidomic profile during the cold response of maize and provide genetic resources for enhancing cold tolerance in crops.

脂肪酸作为烟草中一类重要的化合物,对烟草的生长发育及烟叶的品质风格有重要的影响.近年来,脂肪酸代谢也被证实参与了烟草抗逆性的形成.烟草种子富含油脂和各类脂肪酸,随着烟草种子发育,亚油酸、油酸和棕榈酸含量不断增加,可作为一类潜在的生物质能源加以开发利用.在烟草叶片的生长发育过程中,脂肪酸含量逐渐升高,开花时达到最大,随烟叶成熟衰老而逐渐降低,同时饱和脂肪酸逐渐转变为不饱和脂肪酸.烟叶中、下部叶片脂肪酸含量高于上部烟叶,栅栏组织中高于海绵组织中.此外,基因型以及光照、温度、地理因素、施肥、烘烤方法、机械伤害等环境因素均显著影响烟叶内脂肪酸的组成、含量及其脂肪酸生物合成和代谢关键酶活性和基因表达.低温锻炼可显著提高烟叶内多不饱和脂肪酸含量,降低饱和脂肪酸含量,提高烟叶的耐冷性.通过基因工程手段在烟草中过表达脂酰-ACP去饱和酶、酰基载体蛋白、脂肪酸去饱和酶及脂肪酸脱氢酶等基因可有效提高烟草内不饱和脂肪酸的含量,增强烟草在干旱、高温、强光等非生物胁迫环境下的抗逆性.基于以上结果,提出未来的研究方向,旨在为该领域的研究提供理论和实践指导.

酰基载体蛋白是脂肪酸途径中重要的组件,能够结合脂肪酸代谢途径中各种脂肪酰基中间体,在脂肪酸代谢中是不可或缺的辅因子.以本实验室筛选保存的海洋季也蒙毕赤酵母基因组为模板,PCR扩增酰基载体蛋白基因,获得384 bp的目的片段.生物信息学分析显示,其具有完整的开放阅读框,编码127个氨基酸,有磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,为非分泌型亲水性蛋白,不存在信号肽,存在9个潜在的磷酸化位点,二级结构和三级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主,与已知的酰基载体蛋白结构有很高的相似性.

[目的]系统鉴定哈氏弧菌脂酰-ACP合成酶(Acyl-ACP synthetase,AasS)以不同链长游离脂肪酸和非脂肪链羧酸作为底物的体外催化反应.[方法]利用非变性蛋白质凝胶电泳和紫外分光光度计法从定性和定量两个方面分析了AasS的体外催化功能与活性.[结果]AasS能够催化不同链长直链的自由脂肪酸合成脂酰-ACP,其中以C6–C12作为底物时活性最高;以羟基脂肪酸作为底物的情况下,AasS催化C8–C14的羟基脂肪酸有较高的活性.非脂肪链羧酸类作为底物的反应中,20种蛋白质氨基酸、苯甲酸和水杨酸均可以作为AasS的底物,合成相应的脂酰-ACP.[结论]本研究系统地证明了哈氏弧菌脂酰-ACP合成酶(AasS)对不同底物的不同催化活性,为生物体内氨基酸代谢和菌黄素合成代谢的研究提供了可行性的分析依据.

脂酰-酰基载体蛋白(fatty acyl-acyl carrier protein,acyl-ACP)是多种生物合成途径中的酰基供体.因供给限制,体外研究常用类似物acyl-CoA替代,而CoA部分和ACP有较大差异,限制了相关酶对底物识别的认识.因此稳定获得大量acyl-ACP是体外研究相关酶的催化机制及其代谢途径的关键.研究以 holo-ACP 和 C4 ～C18 链长脂肪酸为底物,在哈氏弧菌 acyl-ACP 合成酶(Vibrio harveyi acyl-ACP synthetase,VhAasS)催化下合成不同碳链长度的acyl-ACP;通过高效液相色谱(HPLC)方法,确定不同碳链长度acyl-ACP的合成产率.结果表明:碳链为C4～C14的acylACP产率均高于90.0％ ,16∶0-ACP产率为85.9％ ,18∶1-ACP产率仅为25.7％ .通过加入Li+优化反应体系,16∶0-ACP、18∶1-ACP的产率达90.0％ .进一步优化扩大反应体系可稳定获得20mg以上acyl-ACP;最后,把合成的acyl-ACP应用到甘油-3-磷酸酰基转移酶催化的反应体系中.不同链长acyl-ACP的规模化合成研究,为体外研究相关酶的催化机制提供重要基础.

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferases,PPTase)可催化脂肪酸合酶(fatty acid synthases,FAS)、聚酮合成酶(polyketide synthases,PKS)以及非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide syntethases,NRPS)的酰基载体蛋白(acyl carrier protein,ACP)及肽酰载体蛋白(peptidyl carrier protein,PCP)等的翻译后修饰反应,将辅酶A(coenzymeA,CoA)上的磷酸泛酰巯基乙胺基转移到ACP及PCP的保守丝氨酸残基上,从而激发ACP及PCP的活性,由此脂肪酸、聚酮、非核糖体肽得以合成.在大部分真菌及细菌中都存在着PPTase,且其在生物代谢中起到重要的作用.现对其研究进展进行阐述.

目的:通过在大肠埃希菌BL21中表达白念珠菌酰基载体蛋白1(acyl carrier protein 1,Acp1),以制备高纯度的目的蛋白.方法:采用PCR扩增目的基因ACP1后,在序列的C端拼接上6xHis tag及终止子,拼接完成后连接构建到质粒中,成为原核表达载体pET30a-ACP1,转化人大肠埃希菌感受态细胞BL21中,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达.收集表达产物后通过镍离子螯合柱纯化,最终利用考马斯亮蓝Bradford法测得目的蛋白含量.结果:白念珠菌酰基载体蛋白Acp1在大肠埃希菌BL21中高效表达;抽提纯化蛋白后行蛋白电泳检测,结果显示,在还原条件下Acp1一直存在2条相对分子质量为17 000的条带.经还原和非还原电泳及蛋白印迹法检测,结果显示该蛋白在非还原状态下有聚集.利用Bradford方法测得蛋白Acp1浓度为2.68 mg/mL.结论:成功制备了白念珠菌酰基载体蛋白Acp1,为后期利用荧光偏振法筛选靶点为Ppt2酶的临床药物提供基础.

3-酮脂酰ACP还原酶(FabG)在细菌中广泛存在并且十分保守,已经发现的所有FabG及其同系物都具有类似的催化活性中心序列,隶属于短链醇脱氢酶/还原酶(SDRs)超家族成员.它是II型脂肪酸合成反应中的关键酶,将3-酮脂酰ACP还原为3-羟脂酰ACP多以NADPH作为辅酶.从搜集的文献来看,国内外针对不同细菌中3-酮脂酰ACP还原酶同系物的研究报道体现了其多样性的特点.但是,近年来,该方面的专题综述十分少见.本文主要对3-酮脂酰ACP还原酶的结构特征、在脂肪酸合成和其他方面的生物学功能,以及以该酶为作用靶点的抑菌剂等方面进行概述,以期为将来3-酮脂酰ACP还原酶的深入研究提供理论参考.

[目的]假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但是催化该转化的酶尚不清楚.本文鉴定了该菌株的一个新的3-酮酰基-ACP还原酶(ANI01589.1),并对其进行了功能研究.[方法]首先,我们克隆了该3-酰基-ACP还原酶的编码基因,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行了异源表达;利用金属离子亲和层析法,纯化获得了重组蛋白.体外检测了重组蛋白的活性与酶学性质,并利用高效液相色谱法(HPLC)测定了该酶的催化产物.[结果]3-酮酰基-ACP还原酶可被17β-雌二醇诱导表达,重组蛋白纯化量可达19.6 mg/L.蛋白序列比对结果表明,该蛋白包含短链脱氢酶/还原酶(SDR)的2个共有区域和多个保守残基.该酶以NAD+为辅助因子,将17β-雌二醇转化为雌酮;其Km值为0.071 mmol/L,kcat值为2.4±0.06/s-1,5 min内可转化超过95.8％的雌二醇.该酶的最佳反应温度为42℃C,最佳pH为8.0.不同二价离子对该酶的活性影响不同,Mg2+和Mn2+可增强其酶活性.[结论]这一假单胞菌SJTE-1来源的3-酮酰基-ACP还原酶可高效催化17β-雌二醇的转化,该酶可能在该菌株的雌激素代谢过程中起到重要作用.

硬脂酰-ACP △9脱氢酶(Stearoyl-acyl carrier protein △9 desaturase,SAD)在质体中催化单不饱和油酸或棕桐油酸的合成,是控制植物细胞饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比例的关键酶.为解析大豆油酸合成积累调控机制,文中对大豆Glycine max GmSAD家族成员进行全基因组鉴定和保守功能域及理化性质等分析.应用qRT-PCR检测GmSAD各成员的时空表达谱,构建表达载体并通过农杆菌介导烟草Nicotiana tabacum瞬时表达和油酸缺陷型酵母Saccharomyces cerevisiae突变株BY4389遗传转化测试GmSAD酶活性和生物学功能.结果 表明,大豆基因组含有5个GmSADs家族成员,其编码酶蛋白均具有二铁中心和SAD酶特有的2个保守组氨酸富集基序(EENRHG和DEKRHE),预测其活性酶蛋白为同源二聚体.系统进化分析显示5个GmSAD分成2个亚组,分别与拟南芥AtSSI2和AtSAD6亲缘关系较近.GmSAD各成员在大豆根、茎、叶、花和不同发育时期种子等组织中表达谱差异明显,其中GmSAD5在发育种子中、晚期高量表达,与油脂富集时期相吻合.烟草叶片瞬时表达GmSAD5可使叶片组织中油酸和总油脂含量分别提高5.56％和2.73％,而硬脂酸含量相应降低2.46％.缺陷型酵母遗传转化测试显示,过表达GmSAD5能恢复缺陷酵母合成单不饱和油酸的能力和促进油脂积累.总之,大豆GmSAD5对硬脂酸底物选择性较强,能高效催化单不饱和油酸的生物合成,为大豆种子油酸和总油脂积累机制的研究奠定了基础,也可作为油脂品质遗传改良的优异靶标.