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靶向抗TIGIT和PVRIG双特异抗体的制备及体外生物性活性的研究
编辑人员丨6天前
目的 制备靶向抗T细胞免疫球蛋白-ITIM结构域蛋白(T cell immune receptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)和脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域蛋白(Poliovirus re-ceptor-related immunoglobin domain-containing protein,PVRIG)双特异抗体,探究其体外生物学活性.方法 用PVRIG人源化抗体hP1和TIGIT人源化抗体hT1构建KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体,将纯化得到KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体进行SDS-PAGE凝胶电泳、热稳定性检测和稳定性分析;采用流式细胞术(Fluorescence activated cell sor-ting,FACS)检测双特异性抗体的结合活性;采用生物干涉膜技术(Bio-layer interferometry,BLI)检测双特异性抗体亲和力;用 Jurkat-NFAT-Luc2-PD1-TIGIT-PVRIG 细胞和 293T-OS8-PVRL2-PDL1细胞中检测双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV对于TIGIT/PVRIG靶点的阻断作用;采用CMV recall assay法检测IFN-r在上清液中的浓度.结果 SDS-PAGE凝胶电泳结果显示KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体纯度>95%;Tm结果为Tm1:66.34,Tm2:80.95.采用SEC-HPLC对双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV进行稳定性分析,其纯度均>90%.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体和PVRIG的人源化抗体hP1与293T-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.168 70 μg/mL 和 0.038 65 μg/mL,与 293T-cyno-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.037 14 μg/mL 和 0.031 98 μg/mL,与 Human PVRIG Protein,His Tag的亲和力为 1.74E-10M 和 1.69E-10M.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 抗体和 TIGIT 的人源化抗体 hT1 与 293T-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.070 27 μg/mL 和 0.031 21 μg/mL;与293T-cyno-TIGIT cell line 的 EC50 分别为 0.020 28μg/mL 和 0.028 22 μg/mL;与 Human TIGIT Protein,His Tag 的亲和力为 8.50E-10M 和 8.47E-10M.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 抗体具有阻断 PD1/PDL1/TIGIT/PVRIG 相互作用活性,且 KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 的 EC50为 0.007 μg/mL,优于单独人源化抗体 hT1(EC50为 0.013 μg/mL)和 hP1(EC50为 0.048 μg/mL)的作用.在含 pp65 peptide 条件下 KY-TIGIT-h1gG4M-PVRIG-SCFV 抗体分泌 IFN-r 为 349.72 pg/mL,明显高于其他抗体.结论 KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体具有高亲和力和良好的生物学活性,有望开发成为肿瘤免疫治疗的抗体药物.
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编辑人员丨6天前
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靶向甲型流感病毒血凝素蛋白的广谱抗体制备及鉴定
编辑人员丨6天前
目的:制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白的广谱抗体FHA3,并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)序列信息,PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列,连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ,构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FHA3。ELISA检测FHA3与甲型流感病毒HA的结合。假病毒感染宿主细胞试验检测抗体FHA3的体外中和活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FHA3。FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合,且呈浓度依赖效应。FHA3具有较好的体外中和活性,在低浓度下(5 μg/ml)能有效阻断H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞,在0.012 5 μg/ml浓度下能有效阻断H1N1假病毒入侵靶细胞。结论:获得1株具有体外中和活性的靶向甲型流感病毒HA蛋白的广谱抗体。
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编辑人员丨6天前
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猪带绦虫14-3-3.2原核表达系统的构建及其在猪带绦虫成虫和囊尾蚴中的表达
编辑人员丨6天前
目的:建立猪带绦虫(Ts)14-3-3.2原核表达系统,并观察Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。方法:在遵义医科大学寄生虫学教研室前期获得Ts14-3-3.2基因序列的基础上,采用基于PCR的精确合成(PAS)方法全基因合成Ts14-3-3.2基因,经限制性内切酶 NdeⅠ和 XbaⅠ双酶切后连接质粒pCzn1,构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2。将重组质粒转化至大肠埃希菌ArcticExpress感受态细胞中诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色分析和鉴定表达产物,通过镍(Ni)柱亲和纯化获得纯化Ts14-3-3.2重组蛋白。采用该纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体,采用免疫印迹法(Western blot)检测Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。 结果:成功构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2,诱导表达后菌体上清液和沉淀均在相对分子质量约29.31 × 10 3处出现Ts14-3-3.2目的蛋白条带。纯化后带有His标签的Ts14-3-3.2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别,获得效价为1∶512 000的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Western blot结果显示,Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中均有表达。 结论:成功建立Ts14-3-3.2原核表达系统,获得了高纯度、高效价的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴阶段均有表达。
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编辑人员丨6天前
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重组2型脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备及免疫原性初步研究
编辑人员丨6天前
目的:构建共表达P1和3CD的重组杆状病毒,利用昆虫细胞重组表达2型脊髓灰质炎病毒(poliovirus type 2,PV2)的病毒样颗粒(virus-like particle, VLP),制备PV2-VLP进行初步免疫原性研究。方法:基于粉纹夜蛾细胞(High 5)密码子偏好性,将PV2的P1基因和3CD基因进行序列优化,并对P1基因进行稳定性突变,构建突变型rBac-PV2-P1s-3CD和野生型rBac-PV2-P1-3CD杆状病毒。Western blot分别检测目的蛋白表达量,离子交换层析纯化PV2-VLP,透射电镜观察VLP高级结构确定组装效率。免疫大鼠评估免疫原性。结果:成功构建了可稳定表达P1s蛋白和3CD蛋白的重组杆状病毒。Western blot结果表明热稳定性突变后VLP产量相比野生型有所提高。电镜观察发现直径约30 nm的三维结构,表明VLP成功组装。动物实验结果表明,重组制备的PV2-VLP具有免疫原性,且能有效刺激产生中和抗体。结论:用昆虫细胞-杆状病毒表达系统可成功制备有效的VLP类疫苗,为PV-VLP疫苗的研制提供参考。
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编辑人员丨6天前
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靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶抗体的制备及鉴定
编辑人员丨6天前
目的:制备1株靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的功能性抗体FNA1,并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)序列信息,合成FNA1重链以及轻链可变区序列,连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ,构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FNA1。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FNA1。ELISA检测FNA1与甲型流感病毒N1亚型NA抗原的结合,流式细胞术分析FNA1与细胞膜表面表达N1亚型NA抗原的结合。通过抗体抑制NA蛋白活性试验检测抗体FNA1的体外功能活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FNA1。FNA1特异性识别结合N1亚型的NA抗原,且呈浓度依赖效应。FNA1能通过结合细胞膜表面表达的N1亚型NA蛋白,有效阻断细胞膜表面的NA活性,从而抑制包装的假病毒从细胞表面释放,继而抑制进一步的靶细胞感染。结论:获得1株具有体外功能活性的靶向甲型流感病毒N1亚型NA蛋白的抗体FNA1。
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编辑人员丨6天前
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褪黑素减轻LPS致大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的机制:褪黑素受体与线粒体分裂蛋白的关系
编辑人员丨6天前
目的:评价褪黑素受体与线粒体分裂蛋白的关系,明确褪黑素减轻LPS致大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的机制。方法:将大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞以密度2×10 5个/ml接种于6孔板,采用随机数字表法分为5组( n=10):对照组(C组)、LPS组(L组)、LPS+褪黑素组(LM组)、LPS+褪黑素受体阻断剂组(LL组)和LPS+褪黑素+褪黑素受体阻断剂组(LML组)。采用10 μg/ml LPS孵育24 h的方法制备LPS致细胞损伤模型;于LPS孵育前12 h时,分别向LM组、LL组和LML组加入褪黑素0.1 mmol/L和/或褪黑素受体阻断剂luzindole 0.2 μmol/L。细胞孵育结束后,采用ELISA法测定培养液TNF-α和IL-6浓度。采用GENMED纯化线粒体呼吸控制率(RCR)定量检测试剂盒测定各组RCR。采用Western blot法测定细胞线粒体动力相关蛋白1(Drp1)和线粒体分裂相关蛋白1(Fis1)的表达。 结果:与C组比较,L组、LM组、LL组和LML组细胞培养液TNF-α和IL-6浓度升高,RCR降低,线粒体Drp1和Fis1表达上调( P<0.05);与L组比较,LM组细胞培养液TNF-α和IL-6浓度降低,RCR升高,线粒体Drp1和Fis1表达下调( P<0.05),LL组上述各指标差异无统计学意义( P>0.05);与LM组比较,LML组细胞培养液TNF-α和IL-6浓度升高,RCR降低,线粒体Drp1和Fis1表达上调( P<0.05)。 结论:褪黑素减轻LPS致大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的机制与激活褪黑素受体,抑制线粒体分裂蛋白表达有关。
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编辑人员丨6天前
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幽门螺杆菌鞭毛蛋白FliD免疫学特征的初步研究
编辑人员丨6天前
目的:初步研究幽门螺杆菌( Helicobacter pylori ,HP)鞭毛蛋白FliD的部分免疫学特征。 方法:原核表达重组FliD蛋白;制备rFliD兔多克隆抗体,同时酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测rFliD特异性免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)与免疫球蛋白M(immunoglobulin M, IgM)水平;酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot, ELISPOT)检测rFliD刺激Hp患者外周血单核细胞(peripheral blood monocytes, PBMC)后的γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)及白细胞介素4(interleukin4, IL-4)表达水平;流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测rFliD蛋白刺激胃粘膜上皮细胞(Gastric epithelial cells, GES-1)细胞后的凋亡比例。结果:rFliD原核表达纯化成功;成功制备高效价rFliD兔多克隆抗体,并发现rFliD可诱导家兔产生高水平IgG与IgM,与免疫前血清比差异具有统计学意义( t值分别为5.42、8.18, P值均<0.05)),效价可达1:102 400;与健康对照组(healthy control, HC)相比,HP组rFliD特异性IFN-γ与IL-4均显著增高( t值分别为21.91, 13.57, P值均<0.05),但产生IFN-γ的水平显著高于IL-4( t=7.55, P< 0.05);与磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)对照组相比,rFliD刺激GES-1细胞后24或72 h均可发生显著性凋亡且差异具有统计学意义( t值分别为10.12、10.90, P值均<0.05)。 结论:幽门螺杆菌鞭毛FliD蛋白具有强免疫原性,可诱导产生较强的体液及细胞免疫应答,且细胞免疫应答以IFN-γ高表达的Th2型为主;同时发现其对GES-1细胞存在一定程度的凋亡效应。
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编辑人员丨6天前
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甲型流感病毒血凝素头部蛋白结构域的原核表达及血清学分析
编辑人员丨6天前
目的:在原核系统中表达流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)头部蛋白并进行血清学分析。方法:将H1N1和H3N2型流感病毒的HA头部蛋白编码基因克隆到pET-22b(+)原核表达质粒中,通过IPTG诱导,在大肠埃希菌BL21中获得含有HA头部与His-Tag的融合蛋白rH1N1-HA和rH3N2-HA。SDS-PAGE分析IPTG诱导前后的融合蛋白,验证表达的准确性,Western blot验证重组蛋白的表达。纯化重组蛋白,多剂次免疫家兔,获得针对H1N1-HA和H3N2-HA头部的多克隆抗体。同时,重组蛋白免疫BALB/c小鼠,评价其免疫原性。结果:rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白在小鼠体内诱导了滴度高于40的血凝抑制抗体,可作为一种保护性抗原。rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白制备的多克隆抗体,可作为Western blot、ELISA等免疫学应用的重要材料。结论:本研究制备的HA头部蛋白可作为一种保护性抗原,在小鼠体内诱导保护性抗体。HA头部制备的多克隆抗体,可用于甲型流感病毒的免疫学和血清学研究。
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编辑人员丨6天前
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人A组轮状病毒G1P[8]基因型VP7蛋白的表达及其抗体制备
编辑人员丨6天前
目的:表达和纯化人A组G1P[8]轮状病毒VP7蛋白(G1 VP7);制备VP7多克隆抗体并进行抗体功能鉴定。方法:利用杆状病毒系统表达G1 VP7蛋白,通过亲和层析法进行蛋白纯化。将纯化后的G1 VP7蛋白免疫新西兰大白兔制备兔多抗血清,纯化得到G1 VP7兔多抗。通过免疫印迹(Western blot, WB)、酶联免疫吸附(ELISA)和免疫荧光试验进行多抗功能验证。结果:利用杆状病毒表达系统获得人A组G1P[8]轮状病毒可溶VP7蛋白,并且G1 VP7蛋白主要以三聚体形式存在;制备得到G1 VP7多抗,ELISA结果显示VP7多抗具有较高的效价;WB和ELISA实验表明VP7多抗能够识别多个G型轮状病毒的VP7;免疫荧光试验结果进一步显示G1 VP7多抗可以结合不同A组轮状病毒,包括Wa株(基因型G1P[8])、DS-1(基因型G2P[4])、SA11(基因型G3P[2])、人G9P[8]株。此外,双夹心ELISA初步结果显示包被VP7多抗可以检测到轮状病毒临床样本。结论:本研究成功得到可溶G1 VP7蛋白并制备VP7多抗;G1 VP7多抗可以结合多种G型轮状病毒,为不同G型轮状病毒检测方法的建立奠定基础。
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编辑人员丨6天前
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两种呼吸道合胞病毒PreF三聚体重组蛋白疫苗的制备和免疫原性评价
编辑人员丨6天前
目的:通过基因序列设计及优化,构建质粒并表达纯化出4种呼吸道合胞病毒(RSV) PreF蛋白,对其免疫原性进行评价。方法:分别用Human和CHO密码子优化Coronin-1A和T4三聚体蛋白基因序列,并添加到RSV F蛋白序列后,将上述质粒转染Expi293F细胞进行蛋白质表达,收获上清经镍柱纯化后,制备出4种三聚体蛋白,并进行SDS-PAGE分析及Western blot鉴定。于0周和3周免疫动物,采血后进行结合抗体和中和抗体活性检测。结果:SDS-PAGE分析及Western blot鉴定结果表明,制备及表达的4种蛋白质具有稳定的三聚体结构;抗原抗体亲和力试验表明,4种三聚体蛋白与RSV特异性单抗8897、D25、Motavizumab、AM14和Palivizumab的亲和力均很强;免疫血清的结合抗体效价和中和抗体效价结果表明,初次免疫后,两种T4三聚体蛋白诱导的抗体水平更高,再次免疫后,Human密码子优化的三聚体蛋白抗体增长幅度较高。结论:两种不同的异源三聚体基序添加均可产生有效的三聚体PreF蛋白,并能在小鼠体内诱导出有效的结合抗体和中和抗体。
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编辑人员丨6天前
