酰基载体蛋白是脂肪酸途径中重要的组件,能够结合脂肪酸代谢途径中各种脂肪酰基中间体,在脂肪酸代谢中是不可或缺的辅因子.以本实验室筛选保存的海洋季也蒙毕赤酵母基因组为模板,PCR扩增酰基载体蛋白基因,获得384 bp的目的片段.生物信息学分析显示,其具有完整的开放阅读框,编码127个氨基酸,有磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,为非分泌型亲水性蛋白,不存在信号肽,存在9个潜在的磷酸化位点,二级结构和三级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主,与已知的酰基载体蛋白结构有很高的相似性.

脂酰-酰基载体蛋白(fatty acyl-acyl carrier protein,acyl-ACP)是多种生物合成途径中的酰基供体.因供给限制,体外研究常用类似物acyl-CoA替代,而CoA部分和ACP有较大差异,限制了相关酶对底物识别的认识.因此稳定获得大量acyl-ACP是体外研究相关酶的催化机制及其代谢途径的关键.研究以 holo-ACP 和 C4 ～C18 链长脂肪酸为底物,在哈氏弧菌 acyl-ACP 合成酶(Vibrio harveyi acyl-ACP synthetase,VhAasS)催化下合成不同碳链长度的acyl-ACP;通过高效液相色谱(HPLC)方法,确定不同碳链长度acyl-ACP的合成产率.结果表明:碳链为C4～C14的acylACP产率均高于90.0％ ,16∶0-ACP产率为85.9％ ,18∶1-ACP产率仅为25.7％ .通过加入Li+优化反应体系,16∶0-ACP、18∶1-ACP的产率达90.0％ .进一步优化扩大反应体系可稳定获得20mg以上acyl-ACP;最后,把合成的acyl-ACP应用到甘油-3-磷酸酰基转移酶催化的反应体系中.不同链长acyl-ACP的规模化合成研究,为体外研究相关酶的催化机制提供重要基础.

目的:通过在大肠埃希菌BL21中表达白念珠菌酰基载体蛋白1(acyl carrier protein 1,Acp1),以制备高纯度的目的蛋白.方法:采用PCR扩增目的基因ACP1后,在序列的C端拼接上6xHis tag及终止子,拼接完成后连接构建到质粒中,成为原核表达载体pET30a-ACP1,转化人大肠埃希菌感受态细胞BL21中,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达.收集表达产物后通过镍离子螯合柱纯化,最终利用考马斯亮蓝Bradford法测得目的蛋白含量.结果:白念珠菌酰基载体蛋白Acp1在大肠埃希菌BL21中高效表达;抽提纯化蛋白后行蛋白电泳检测,结果显示,在还原条件下Acp1一直存在2条相对分子质量为17 000的条带.经还原和非还原电泳及蛋白印迹法检测,结果显示该蛋白在非还原状态下有聚集.利用Bradford方法测得蛋白Acp1浓度为2.68 mg/mL.结论:成功制备了白念珠菌酰基载体蛋白Acp1,为后期利用荧光偏振法筛选靶点为Ppt2酶的临床药物提供基础.

[背景]链霉菌属于放线菌科,在土壤环境中广泛分布.链霉菌具有复杂的形态分化和多样性的次生代谢网络,能产生大量具有生物活性的次级代谢产物,被广泛深入研究.[目的]天蓝色链霉菌是链霉菌的模式菌株,其脂肪酸合成代谢与次级代谢联系紧密,但目前脂肪酸合成代谢途径还不清楚,其长链3-酮脂酰ACP合成酶还未见报道.[方法]利用大肠杆菌FabF序列进行同源比对,发现天蓝色链霉菌A3(2)的基因组中,SC02390 (ScoFabFl)、SC01266 (ScoFabF2)、SC00548(ScoFabF3)和SC05886 (ScoRedR)具有较高的相似性,并具有保守的Cys-His-His催化活性中心,可能具有长链3-酮脂酰ACP合成酶活性.采用PCR扩增方法分别获得以上基因,连入表达载体pBAD24M后分别互补大肠杆菌abB(ts)突变株和fabB(ts)fabF双突变株,并检测转化子的生长情况.以上基因与pET-28b连接后,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并利用Ni-NTA纯化获得蛋白,体外测定其催化活性.将以上基因分别互补大肠杆菌abF突变株后,GC-MS测定互补株的脂肪酸组成.[结果]4个同源基因中,只有SeofabF1能恢复abB(ts)fabF双突变株42℃时在添加油酸条件下的生长,其他3个基因均不能恢复生长.而这4个基因都不能恢复abB(ts)突变株42℃时生长.体外活性测定ScoFabF1具有长链3-酮脂酰ACP合成酶活性,其他3个蛋白都不具有该活性.仅ScofabF1能显著提高大肠杆菌abF突变株的顺-11-十八碳烯酸(C18∶1)比例,其他3个基因都不具有该功能.[结论]天蓝色链霉菌中ScofabF1编码长链3-酮脂酰ACP合成酶Ⅱ,在脂肪酸利用过程中发挥重要作用.天蓝色链霉菌中没有发现编码长链3-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ的基因,其可能通过其他途径合成少量的不饱和脂肪酸.以上研究结果为进一步研究天蓝色链霉菌中脂肪酸合成机制奠定了基础.

作者将MS2噬菌体壳蛋白基因连接于pTACH质粒，以 E. coli TG1株表达出融合蛋白，用硫酸铵粗提蔗糖梯度离心纯化，通过高浓度冰乙酸使壳蛋白解体，用TMK缓冲液中和，与TAT反链基因片段混合反应，使之包裹于MS2壳蛋白。以化学修饰法使此装配的MS2带上游离巯基，在转铁蛋白的氨基上接入马来酰胺键。藉此二键连成MS2-TAT-TF复合物。在氯霉素乙酰转移酶试验中，此导向基因治疗剂对HIV的TAT基因转染的HeLa细胞有明显的抑制增殖作用，提示本基因治疗剂可应用于预防和治疗HIV感染，即MS2噬菌体壳蛋白作为反链基因载体显出一定前景。

棕榈油酸(C16:1△9)等ω-7脂肪酸是一类单不饱和脂肪酸,具有重要的营养、医药和工业价值.猫爪藤(Dolichandra unguis-cati)种子富含棕榈油酸,种子中的酰基-ACP-△9脱氢酶(DuACP-△9D)能高效催化棕榈酸(C16:0)生成棕榈油酸.为获得富含ω-7脂肪酸的优异藻株,将DuACP-△9D基因组成型表达载体pCAMBIA1303-DuACP-△9D通过玻璃珠法导入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC849藻细胞,Du-ACP-△9D基因在藻细胞中成功表达.与野生型莱茵衣藻CC849相比,转化藻株1和2中总油脂积累显著增加,尤其是棕榈油酸含量分别提高到8.64和8.22 mg·g-1.转化藻株的光合作用和生长特性未现负效应.硫胁迫处理导致转化藻株的总脂和棕榈油酸含量进一步显著上升.转化藻株碳水化合物和蛋白质含量则明显降低.总之,异源表达DuACP-△9D基因可显著提高微藻细胞总油脂积累和ω-7脂肪酸的富集,且未对其他性状产生不利影响.研究为未来应用微藻规模化生产高附加值ω-7油脂提供新种质.

硬脂酰-ACP脱氢酶(stearoyl-ACP desaturase,SAD)是植物体内重要的脂肪酸去饱和酶之一.qRT-PCR表达分析发现,山茶硬脂酰-ACP脱氢酶基因CjSAD1被低温迅速诱导表达.从山茶品种'绎雪'中克隆了CjSAD1,该基因CDS长789 bp,编码263个氨基酸,具有2个典型的铁离子结合位点,属于类铁蛋白超家族成员.进化分析表明,CjSAD1蛋白与茶树、油橄榄等物种的同源蛋白亲缘关系较近.构建CjSAD1植物超量表达载体并转化拟南芥,转基因后代叶片不饱和脂肪酸组分发生改变,C18∶1脂肪酸含量显著增加.对转基因植株进行-3℃低温胁迫处理,转基因植株胁迫后存活率显著高于野生型对照,且丙二醛和相对电导率的增加量明显低于野生型对照.上述结果表明山茶CjSDA1能够增强植物对低温的抗性,该研究为通过基因工程方法提高植物耐寒性提供了潜在的基因资源.

为筛选紫玉兰'红元宝'(Magnolia liliflora'Hongyuanbao')二次花芽分化阶段稳定表达的内参基因,该研究以'红元宝'不同花芽分化时期的花芽和叶为材料,基于转录组数据,筛选出8个候选内参基因,即泛素酶基因(UBC)、肌动蛋白(ACT)、微管蛋白 β 链(β-TUB)、微管蛋白 β-5链(β-TUB5)、微管蛋白 α-3链(α-TUB3)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)、酰基载体蛋白2(ACP2)、酰基载体蛋白3(ACP3).运用Primer Premier 5设计引物,简单克隆和熔解曲线验证引物特异性;利用qRT-PCR技术检测各个候选内参基因的表达情况,结合GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件和RefFinder在线工具综合评估其表达稳定性,并通过目的基因TFL1的表达分析验证其可靠性.结果表明:(1)8个候选内参基因条带位置正确,熔解曲线呈单一峰,说明引物特异性良好.(2)β-TUB、β-TUB5和α-TUB3是'红元宝'不同花芽分化时期较为稳定的内参基因,而UBC和ACT为稳定性最低的内参基因.(3)β-TUB5、α-TUB3、β-TUB及其组合的相对表达量趋于一致,而ACT和UBC并未对目的基因的表达量进行有效的标准化.因此,β-TUB、β-TUB5和α-TUB3可作为'红元宝'二次花芽分化研究中稳定表达的内参基因.该研究结果将为木兰属植物二次成花分子调控机制研究提供依据.

[背景]丙二酰单酰辅酶A:酰基载体蛋白转酰基酶(malonyl coenzyme A:acyl carrier protein transacylase,MCAT)是Ⅱ型脂肪酸合酶(fatty acid synthase Ⅱ,FASII)的重要亚基,与脂肪酸合成直接相关,然而关于微藻MCAT的信息却很少.[目的]验证三角褐指藻MCAT的功能.[方法]在模式硅藻三角褐指藻的全基因组序列中发现了一个可能的mcat基因序列,对其进行生物信息学分析,构建原核表达载体,并转入MCAT缺陷型大肠杆菌L48菌株中,最后利用GC-MS分析突变株脂肪酸的成分和含量.[结果]三角褐指藻MCAT主要结构为α-螺旋和无规则卷曲,与圆柱脆杆藻的亲缘关系最为接近,为protits型MCAT;三角褐指藻MCAT的表达使MCAT缺陷型大肠杆菌L48菌株恢复了合成脂肪酸的功能;对L48回复突变株的脂肪酸组成进行分析,发现该酶对C14:0具有底物偏好性,从而促进中长链脂肪酸如C16:0和C17:1的合成,这一特点与protits型MCAT的特性基本相符.[结论]三角褐指藻MCAT能促进脂肪酸的合成,这为微藻脂肪酸合成及代谢调控研究提供了新的线索,有利于微藻脂质的研究和应用.