为了初步明确lytR基因的保守性以及探讨LytR蛋白在肺炎链球菌中的生物学功能.本研究利用PCR和测序方法分析lytR基因20种不同序列型肺炎链球菌临床分离株的保守性;利用Western blotting技术分析lytR在细菌不同生长阶段的表达情况;随后,利用红霉素片段替代lytR基因构建D39△lytR缺陷菌株,通过生长曲线分析、电镜下形态观察、以及磷壁酸含量测定揭示LytR蛋白在细菌生长、细菌形态以及磷壁酸合成中的作用.研究发现20种不同序列型肺炎链球菌临床菌株的lytR基因序列一致性＞99.3％;Westem blotting结果显示lytR在细菌不同生长阶段稳定表达;D39△lytR缺陷株生长明显变缓,细菌表现为不成熟自溶;D39△lytR全菌磷壁酸含量显著减少,而培养基上清中的磷壁酸含量显著增多.本研究表明lytR基因非常保守,在肺炎链球菌不同生长阶段均有表达,并可能通过连接酶的作用影响细菌生长和参与肺炎链球菌磷壁酸的合成,有望成为一种新的抗生素和药物靶点.

目的 探索血小板抗金黄色葡萄球菌(SA)的效能并尝试阐明其抗菌作用机制.方法 实验分为SA组和血小板处理组,采用紫外分光光度计测定3次SA组和血小板处理组共6份菌液OD600值及6份菌液涂板菌落计数评价血小板的抗SA效能;分别采用HisSq2000测序仪和Q-Exactive质谱仪做基因转录组学和蛋白质谱分析检测血小板处理金黄色葡萄球菌后在基因转录水平和蛋白水平细菌自溶能力的变化,并通过做qRT-PCR和TritionX-100诱导下细菌自溶能力检测进一步验证.结果 菌液OD600值测定试验显示:终浓度(×109/L)为100、150、200的血小板处理SA 10h后菌液OD600值分别为0.314、0.152、0.234,而对照组为1.223(P＜0.01),其中血小板浓度为150× 109/L时处理SA后OD600值下降幅度明显大于其他血小板浓度处理组(P＜0.01);与对照组SA相比,血小板(150× 109/L)处理SA后,在转录水平上调控细菌自溶活性的双组分系统基因lytS、lytR及其下游基因lrgA、lrgB变化倍数分别为0.165、0.086、0.045、0.107,下调明显(P＜0.01),自溶酶基因atlA为3.596,上调明显(P＜0.01),在蛋白水平上,蛋白质谱分析SA水解酶和自溶酶相对定量:血小板处理组和对照组分别为1.307 vs 0.633、1.326vs0.834(P＜0.01);血小板(150×109/L)处理SA后与对照组在Triton Ⅹ-100的诱导下细菌的浊度(OD600)比较:0.5、1.5、2.5h分别为0.052 vs0.112、0.046 vs0.089、0.048 vs 0.061(P＜0.01).结论 血小板通过作用于金黄色葡萄球菌双组份系统自溶调节基因致细菌发生自溶来发挥抗菌作用;本研究发现所发现的血小板对于金黄色葡萄球菌新的抑菌靶点和途径,或为临床综合治疗细菌性感染提供新的策略和思路.

[目的]须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)基因组中存在一些双组分系统(two-component system,TCS),包括一个LytR调控因子和一个PdtaR转录抗终止调节因子,我们旨在通过基因工程技术改造分析这两个双组分系统蛋白在须糖多孢菌中的作用.[方法]本研究利用融合PCR和属间接合转移技术,构建了 S.pogona-ΔlytR和 S.pogona-PdtaR工程菌株,研究它们对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成的影响.[结果]HPLC检测和质谱鉴定表明,与原始菌相比,S.pogona-ΔlytR中丁烯基多杀菌素产量有所提高,而S.pogona-PdtaR中产量下调,表明lytR和pdtaR对丁烯基多杀菌素生物合成有负调控作用.此外,生长曲线测定和表型分析结果表明,S.pogona-ΔlytR和S.pogona-PdtaR对须糖多孢菌的生长发育和孢子形成也产生了 一定的影响.[结论]本研究为进一步阐明丁烯基多杀菌素生物合成的调控机制奠定了理论基础.