[目的]研究对硝基苯酚(PNP)对大肠杆菌和铜绿假单胞菌产生持留菌的影响,并对转录组进行分析,阐明对硝基苯酚影响持留菌形成的相关机制.[方法]采用氧氟沙星抗生素探究对硝基苯酚对细菌产生持留菌的影响,并通过检测细菌自溶情况和呼吸抑制剂羰酰氰氯苯腙(CCCP)对持留菌比例的影响,然后通过转录组分析其相关基因的表达,最后通过实时荧光定量PCR和反义核酸进行相关功能基因的验证.[结果]PNP可以通过抑制大肠杆菌和铜绿假单胞菌的呼吸作用使其产生持留菌的比例增加,PNP不同浓度、作用不同时间和作用不同生长时期的菌体都会影响细菌产生持留菌的比例.PNP和呼吸抑制剂CCCP均能够抑制2个菌体的自溶情况,包括溶解氧含量的变化、蛋白质降解情况、细胞尺寸的变化和RNA完整性.转录组分析和实时荧光定量PCR实验结果表明加入PNP后,cyoA、appC两个基因在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中的表达量均显著下降,再通过反义核酸抑制cyoA、appC的表达发现持留菌的比例和原始菌株相比均有所增加.[结论]PNP可以通过抑制细胞呼吸作用来增加细菌产生持留菌的比例.

目的:明确肺炎链球菌MarR家族蛋白SPD_0379对细菌磷壁酸(teichoic acids,TA)的调控作用.方法:通过凝胶阻滞实验验证SPD_0379蛋白与rafX基因启动子序列的结合,通过LacZ报告基因观察细菌在spd_0379基因缺陷后的rafX基因表达变化,通过斑点杂交、ELISA和流式细胞术检测细菌磷壁酸的含量变化,通过生长曲线分析揭示SPD_0379蛋白在细菌生长中的作用.结果:SPD_0379蛋白与rafX基因启动子序列发生特异性结合,spd_0379基因缺陷后,细菌的rafX基因表达上调(t=10.010,P=0.001),免疫斑点与ELISA均显示磷壁酸含量明显升高(t=5.848,P=0.004;t=4.653,P=0.001),且缺陷菌的自溶较野生菌明显提前.结论:SPD_0379蛋白负调控rafX基因的表达,抑制细菌磷壁酸的合成,参与细菌自溶的调控.

除最小的甘氨酸外,所有的氨基酸(amino acid,AA)都有手性,以D-氨基酸(DAA)或L-氨基酸(LAA)形式存在.DAA广泛存在于各类生物中,尤其是细菌.DAA虽没有参与蛋白质合成,但DAA尤其是非典型DAA在细菌生理中具有很多特殊功能.在结构性能方面,DAA是细菌细胞壁肽聚糖的重要组分,并参与组成某些非核糖体合成途径产生的生物多肽,少数细菌能产生含有D-Glu的γ-聚谷氨酸.对细胞个体而言,DAA能调节细菌表面电荷和自溶素活性,抑制细菌芽胞萌发,调节稳定期细胞壁的重塑及调节病原菌的毒力等.对细菌群落而言,DAA对生物膜的解聚和细菌生态也具有调控作用.此外,某些DAA还能直接作为营养支持某些细菌的生长,而有的DAA则具有抑菌作用.本文主要综述了DAA在细菌生理过程中发挥多项功能的研究进展.

为了初步明确lytR基因的保守性以及探讨LytR蛋白在肺炎链球菌中的生物学功能.本研究利用PCR和测序方法分析lytR基因20种不同序列型肺炎链球菌临床分离株的保守性;利用Western blotting技术分析lytR在细菌不同生长阶段的表达情况;随后,利用红霉素片段替代lytR基因构建D39△lytR缺陷菌株,通过生长曲线分析、电镜下形态观察、以及磷壁酸含量测定揭示LytR蛋白在细菌生长、细菌形态以及磷壁酸合成中的作用.研究发现20种不同序列型肺炎链球菌临床菌株的lytR基因序列一致性＞99.3％;Westem blotting结果显示lytR在细菌不同生长阶段稳定表达;D39△lytR缺陷株生长明显变缓,细菌表现为不成熟自溶;D39△lytR全菌磷壁酸含量显著减少,而培养基上清中的磷壁酸含量显著增多.本研究表明lytR基因非常保守,在肺炎链球菌不同生长阶段均有表达,并可能通过连接酶的作用影响细菌生长和参与肺炎链球菌磷壁酸的合成,有望成为一种新的抗生素和药物靶点.

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是一种革兰阳性(G+)条件致病菌,常定植于人鼻咽部,近一半健康人携带此菌[1].当人体免疫力降低,定植的肺炎链球菌可穿透黏膜等防御体系引起多种感染.临床上,肺炎链球菌是导致社区获得性肺炎、脑膜炎、中耳炎等的重要病原之一.易感人群包括儿童、老年人,及伴有其他基础疾病(如肿瘤、红斑狼疮)的青壮年患者[2].据报道,每年死于这类病原菌感染的人数与死于结核病的人数大体相当[3].人体常见病原菌中,肺炎链球菌是少有的在生长进入稳定期后能观测到大量自溶的细菌[4].与肺炎链球菌稳定期自溶现象直接相关的生物分子中,有一类称作自溶素(autolysin,Lyt)的蛋白最早引起人们关注.目前,在肺炎链球菌中已发现 LytA、LytB、LytC三种自溶素,且生理功能各不相同.其中,肺炎链球菌所特有、自溶活性最强、研究最深入的是 LytA[5-6].本文重点围绕三种自溶素的结构、功能及部分应用有关的进展进行综述,为进一步揭示细菌自溶现象的生物学本质,并为相关领域研究工作提供参考.

目的 探索血小板抗金黄色葡萄球菌(SA)的效能并尝试阐明其抗菌作用机制.方法 实验分为SA组和血小板处理组,采用紫外分光光度计测定3次SA组和血小板处理组共6份菌液OD600值及6份菌液涂板菌落计数评价血小板的抗SA效能;分别采用HisSq2000测序仪和Q-Exactive质谱仪做基因转录组学和蛋白质谱分析检测血小板处理金黄色葡萄球菌后在基因转录水平和蛋白水平细菌自溶能力的变化,并通过做qRT-PCR和TritionX-100诱导下细菌自溶能力检测进一步验证.结果 菌液OD600值测定试验显示:终浓度(×109/L)为100、150、200的血小板处理SA 10h后菌液OD600值分别为0.314、0.152、0.234,而对照组为1.223(P＜0.01),其中血小板浓度为150× 109/L时处理SA后OD600值下降幅度明显大于其他血小板浓度处理组(P＜0.01);与对照组SA相比,血小板(150× 109/L)处理SA后,在转录水平上调控细菌自溶活性的双组分系统基因lytS、lytR及其下游基因lrgA、lrgB变化倍数分别为0.165、0.086、0.045、0.107,下调明显(P＜0.01),自溶酶基因atlA为3.596,上调明显(P＜0.01),在蛋白水平上,蛋白质谱分析SA水解酶和自溶酶相对定量:血小板处理组和对照组分别为1.307 vs 0.633、1.326vs0.834(P＜0.01);血小板(150×109/L)处理SA后与对照组在Triton Ⅹ-100的诱导下细菌的浊度(OD600)比较:0.5、1.5、2.5h分别为0.052 vs0.112、0.046 vs0.089、0.048 vs 0.061(P＜0.01).结论 血小板通过作用于金黄色葡萄球菌双组份系统自溶调节基因致细菌发生自溶来发挥抗菌作用;本研究发现所发现的血小板对于金黄色葡萄球菌新的抑菌靶点和途径,或为临床综合治疗细菌性感染提供新的策略和思路.

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)作为超级细菌的典型代表,严重威胁人类的健康.目前传统的抗生素治疗和疫苗主动预防都无法有效控制MRSA感染.金黄色葡萄球菌的毒力是由大量的毒力因子决定的,如黏附素、溶血素、自溶素、蛋白酶等.这些毒力因子能够协助菌体黏附、侵袭宿主,是引发机体组织损伤和脓毒症的主要原因.抗菌药物虽然具有较强的杀菌效果,但对毒力因子的作用欠佳,而且在抗菌药物反复作用下,MRSA会裂解释放更多毒素,加重感染.针对毒力因子的中和方面,以抗体为基础的治疗方法未来有望成为一种非常重要的治疗方法.本文主要对近年来国内外抗金黄色葡萄球菌抗体药物研究状况进行综述和展望.

链球菌是人类口腔中最为常见的细菌类群之一,在口腔微生态平衡的维持与致病中发挥了重要作用.口腔链球菌中的大多数可以进入感受态,在此生理状态下,细菌可摄取环境中的DNA并整合进入自身基因组从而获得新的遗传表型或特性.大量研究表明,口腔链球菌的感受态调控通路不是孤立的,与生物膜形成、细菌素产生、耐酸、氧应激、细胞自溶和耐药性等多个表型的调控存在紧密关系,研究这些不同表型间的相互影响对理解口腔菌群稳态及防治疾病有重要意义.本文以变异链球菌、格氏链球菌、血链球菌和肺炎链球菌4种典型的口腔链球菌为代表,对感受态与口腔链球菌多种表型间关系的研究进展做一综述.

构建编码大肠杆菌鞭毛蛋白基因(fliC)失活突变株,并探究其生物被膜形成改变后在应激状态下的生物学特征.使用Thermotargetron靶向基因失活系统,构建fliC基因失活突变株(ΔfliC420s),测定ΔfliC420s与野生型菌株的生长速率、运动能力、生物被膜形成能力、自溶速率、pH敏感性及对抗生素耐受性的变化.ΔfliC420s相比野生型菌株,生长速率未受影响,在半固体培养基中运动能力缺失,生物被膜形成能力明显降低,菌体自溶速率加快,pH敏感性增强,以及对D-环丝氨酸、红霉素、诺氟沙星的耐受性降低.大肠杆菌fliC基因在细菌生物被膜形成和对外界压力的抵抗中具有重要作用.

VicRK是革兰氏阳性菌中高度保守的双组份信号系统之一.组氨酸激酶VicK定位于细胞膜上,可感受细胞内外环境刺激,将信号传递给胞内应答因子VicR,从而调控下游靶基因,维持细胞的生存及调整细菌致病性.本文综述了Vi-cRK在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)及变异链球菌(S.mutans)等革兰阳性菌中的功能调控研究现状,发现VicRK可参与细胞分裂、细胞自溶、环境应激、生物膜形成及毒力因子表达、免疫调控等过程.