目的:本研究旨在探讨微小RNA(miR)-376b-3p和miR-654-5p在大肠癌中的表达水平及其临床意义。方法:荧光定量PCR检测34组来自2018年6月至2019年1月淮安市肿瘤医院大肠癌及癌旁组织中miR-376b-3p和miR-654-5p的表达。利用肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库分析miR-376b-3p和miR-654-5p的表达与大肠癌患者临床病理因素以及生存预后的关系。应用SPSS 17.0软件对所有结果进行统计分析。结果:相对于癌旁组织，大肠癌组织中miR-376b-3p表达下调，miR-654-5p表达上调，差异有统计学意义( P<0.001)。miR-376b-3p表达的降低和miR-654-5p表达的升高与肿瘤的转移和临床分期密切相关。此外，单因素分析结果显示miR-376b-3p的低表达或miR-654-5p的高表达的大肠癌患者总体生存率较低，差异有统计学意义( P<0.05)。多因素分析发现miR-376b-3p低表达和miR-654-5p高表达是大肠癌患者预后差的独立预测因子。 结论:miR-376b-3p的低表达和miR-654-5p的高表达可能与大肠癌的发生、发展明显相关。

目的:研究X射线辐射诱导非小细胞肺癌（NSCLC) A549细胞凋亡的适应性反应，并筛选适应性反应相关的微RNA (miRNA）。方法:将NSCLC A549细胞分为6组，包括50 mGy+20 Gy、200 mGy+20 Gy、20 Gy、50 mGy、200 mGy照射组及对照组（0 Gy），前2组细胞分别用50、200 mGy初始剂量进行照射，培养6 h后用20 Gy的效应剂量进行照射，20 Gy、50 mGy、200 mGy照射组同时进行照射。培养24 h后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。利用小RNA测序技术筛选差异表达miRNA，并对其靶基因进行基因本体（GO）及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路的功能富集分析。采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR）对部分差异表达miRNA进行验证。2组间数据的比较采用Welch t检验。 结果:50 mGy+20 Gy照射组和200 mGy+20 Gy照射组的A549细胞早期凋亡率分别为（1.81±0.11）%和（2.17±0.19）%，低于20 Gy照射组的（4.54±0.23）%，且差异均有统计学意义（ t=10.680、8.006，均 P<0.01）。与20 Gy照射组相比，50 mGy+20 Gy照射组和200 mGy+20 Gy照射组共同差异表达趋势miRNA有1个上调（miR-3662）、15个下调（miR-185-3p、miR-1908-5p、miR-1307-5p、miR-182-3p、miR-92a-3p、miR-582-5p、miR-501-3p、miR-138-5P、miR-1260b、miR-484、miR-378d、miR- 193b-3P、miR-127-3p、miR-1303及miR-654-5p）。GO富集分析结果显示，差异表达miRNA调控靶基因功能显著富集于细胞通讯调节、代谢过程的正向调节、代谢信号的调节、酶结合及催化活性等过程。KEGG富集分析结果显示，靶基因相关信号通路显著富集于溶酶体、丝裂原活化蛋白激酶、Ras和内吞作用等信号通路。qRT-PCR检测结果显示，miRNA表达情况与基因芯片结果趋势一致（10个miRNA表达水平得到验证）。 结论:X射线50、200 mGy照射剂量均能诱导NSCLC A549细胞凋亡的适应性反应，并筛选到一组共同差异表达的miRNA，可能在X射线辐射诱导细胞凋亡的适应性反应中发挥了重要作用，有可能成为调节电离辐射生物效应的潜在靶点。

目的:探讨 TCOF1 mRNA表达下降对人胚胎干细胞系H9来源神经嵴细胞(H9-NCC)凋亡的影响，并阐明对 TCOF1表达发挥转录后调控作用的微RNA(miRNA)以及致畸因子视黄酸(RA)调控 TCOF1表达的作用和机制。 方法:将人胚胎干细胞系H9诱导为H9-NCC，通过免疫荧光染色、流式细胞分析检测神经嵴细胞(NCCs)表面标志物P75、HNK-1、AP2，通过实时定量PCR(RT-qPCR)检测NCCs标志物基因 SOX9、 ZIC1、 AP2、 P75、 PAX3和 SOX10表达情况。采用针对 TCOF1基因的慢病毒RNA干扰载体(sh- TCOF1)在H9-NCC中敲减 TCOF1，并设阴性对照组(sh-Scramble), 观察细胞凋亡状况。通过生物信息学分析，预测可能与 TCOF1 mRNA结合的miRNA为miR-654-5p，利用该miRNA的模拟物，并设阴性对照，采用RT-qPCR方法观察对 TCOF1 mRNA水平的影响。用0.1 μmol/L终浓度的RA处理H9-NCC，观察对 TCOF1 mRNA表达的影响。预测 TCOF1上游转录因子( HOXA3)并通过RNA干扰技术敲减该转录因子，采用RT-qPCR方法检测 TCOF1 mRNA表达水平，探讨RA调控 TCOF1 mRNA表达的机制。 结果:(1)H9-NCC细胞系诱导成功，免疫荧光染色、流式细胞分析及RT-qPCR检测显示诱导产生的H9-NCC表达NCCs特异性标志物。(2)与阴性对照组相比，sh- TCOF1可以敲减H9-NCC中 TCOF1的表达水平( P<0.001)，敲减 TCOF1后可增加细胞晚期凋亡水平( P＝0.029)，上调caspase3表达( P<0.001)。(3)与阴性对照组相比，miR-654-5p模拟物可降低H9-NCC中 TCOF1 mRNA水平( P＝0.019)。(4)与阴性对照组相比，RA处理H9-NCC后 TCOF1 mRNA表达上调( P＝0.041)；敲减 HOXA3可抑制RA对H9-NCC中 TCOF1 mRNA的上调能力( P＝0.008)。 结论:TCOF1表达降低诱导H9-NCC凋亡；miR-654-5p通过转录后调控下调 TCOF1 mRNA表达；RA通过 HOXA3促进 TCOF1表达。

目的 探究miR-654-3p对骨肉瘤细胞增殖的影响,预测其靶基因并评估靶基因对骨肉瘤患者生存预后的干预情况.方法 选择GEO数据库中GSE70367数据集进行差异分析,筛选骨肉瘤细胞中异常表达的miRNA,通过RT-qPCR检测miR-654-3p在骨肉瘤细胞系143B、MG-63、SAOS2和HOS中的表达情况.通过TargetScan和miRmap数据库预测miR-654-3p的靶基因,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-654-3p与GMFB基因的结合.用CCK8实验和CFU实验分析miR-654-3p和GMFB对骨肉瘤细胞MG-63和HOS增殖的影响.下载TCGA数据库中肉瘤患者的GMFB表达数据和临床信息,通过R软件包绘制GMFB对生存预后影响的KM曲线以及预测肉瘤患者1年、3年和5年生存率的列线图.结果 与人正常成骨细胞hFOB1.19相比,骨肉瘤细胞系143B、MG-63、SAOS2和HOS中miR-654-3p的表达均明显降低(P＜0.05).miR-654-3p与GMFB基因结合,并负调控GMFB的表达.miR-654-3p模拟物在体外明显抑制骨肉瘤细胞的增殖,而GMFB转染能够逆转抑制作用(P＜0.05).GMFB高表达的骨肉瘤患者的总体生存率明显低于低表达患者(P＜0.05),且通过列线图能够预测患者的1年、3年和5年生存率.结论 miR-654-3p通过靶向负调控GMFB基因表达,抑制骨肉瘤细胞的增殖,且GMFB高表达与骨肉瘤患者的预后呈负相关.

目的 探讨环状RNA(circRNA)在银屑病发病中的作用.方法 分离、培养15例银屑病患者皮损及15例健康对照皮肤间充质干细胞(MSC),用流式细胞仪及多向分化法进行鉴定.用RNA测序法检测circRNA表达,并进行详细的生物信息学分析.挑选7个差异表达的circRNA构建circRNA-microRNA相互作用网络,从中挑选3个与其相关的microRNA进行qRT-PCR验证.银屑病患者组和对照组qRT-PCR验证结果采用两独立样本t检验.结果 RNA测序结果显示,共检测到6 323个circRNA,其中3 227个为本实验首次发现.与对照组相比,患者组中有129个circRNA呈差异表达,其中123个表达上调,6个表达下调.挑选7个差异circRNA进行circRNA-microRNA相互作用预测,显示与这7个circRNA关系密切的银屑病相关microRNA,包括miR-17-5p、miR-30e-5p、miR-142-3p/5p、miR-369-3p、miR-184、miR-4490、miR-654-3p、miR-423-5p等.qRT-PCR也证实,这7个差异circRNA在患者组也表达上调.与对照组相比,挑选的3个microRNA在银屑病皮损中低表达(t值分别为3.993、3.217、2.918,均P＜0.05).结论 银屑病皮损MSC circRNA表达异常,并可能参与了银屑病发病.

目的 分析血清miR-27与老年2 型糖尿病下肢血管病变及25(OH) D3 水平的关系.方法 选取2017年10月—2019年5月河北省沧州市人民医院内分泌科确诊老年2型糖尿病患者86例为T2DM组,并以有无下肢血管病变分为下肢血管病变 (LLPAD)亚组44例和非下肢血管病变( Non-LLPAD) 亚组42例;选择同期医院门诊健康体检者76例为对照组,测定比较各组血清miR-27 mRNA表达及TC、TG、HDL-C、LDL-C、HbA1c、FPG、25(OH)D3 、hs-CRP、Fib水平.结果 T2DM组miR-27 mRNA、TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG水平高于对照组,25( OH) D3 、HDL-C水平低于对照组( t =13. 371、13. 036、25. 364、19. 698、29. 326、38. 489、95. 524、66. 547,66. 241、8. 698, P均=0. 000);LLPAD 亚组 miR-27 mRNA、TC、TG、LDL-C、Fib、 HbA1c、 hs-CRP、 FPG 水平高于 Non-LLPAD 亚组,25 (OH)D3 、HDL-C水平低于Non-LLPAD亚组(t=5. 275、13. 541、26. 541、8. 965、20. 146、14. 548、14. 369、23. 654、7. 711、9. 491,P均=0. 000);miR-27 mRNA与25(OH)D3 、HDL-C呈负相关(r= -0. 486、-0. 483,P=0. 039、0. 039),与TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG呈正相关(r=0. 651、0. 572、0. 494、0. 747、0. 438、0. 523、0. 591,P均＜0. 05);高水平的miR-27 mRNA、TC及低水平的25(OH)D3 均为老年2型糖尿病合并下肢血管病变发生的危险因素(OR=2. 437、4. 268、13. 625,P＜0. 05);miR-27 mRNA、25(OH)D3 两者的AUC相近,均小于TC;miR-27 mRNA、25( OH) D3 诊断老年2型糖尿病下肢血管病变的敏感度、特异度相近(P＞0. 05),均小于TC(P＜0. 05).结论 老年2型糖尿病下肢血管病变患者血清miR-27 mRNA水平升高,与25(OH)D3 呈负相关;miR-27、25(OH)D3 诊断2型糖尿病下肢血管病变具有较高的敏感度、特异度,可作为判定2型糖尿病下肢血管病变的生物学标志物.

目的 筛选与结核病相关,且靶向调控维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)的microRNA(miRNA),为深入研究维生素D(vitamin D,VitD)辅助抗结核病机制及其临床应用提供一定的参考依据.方法 选择5例明确诊断肺结核病患者和5例非结核病的志愿者作为研究组和对照组.分别收集临床基线资料以及采集两组外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)作为临床样本,提取总RNA后,采用高通量测序技术(high-throughput sequencing),检测两组间的miRNA差异表达情况.结果 5例肺结核病患者和5例非结核病志愿者临床基线资料经统计学分析得出两组间23项指标的同质性和异质性,其中性别、年龄、吸烟饮酒习惯等两组间无统计学差异;体重指数(BMI)、总胆固醇(TC)、血红蛋白(Hb)白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)及总蛋白(TP)研究组低于对照组,有统计学差异(P<0.05).高通量测序从研究组和对照组5对样本中共筛选出1560条miRNAs,得到miRNA在两组中差异表达谱.分层聚类和火山图进一步综合分析发现研究组中最有差异的23条miRNAs(P<0.05),其中15条miRNAs在研究组中表达下(∣LOG2FC∣>1),8条miRNAs表达上调(FC>1).综合高通量测序结果和生物信息学预测,从差异表达谱中筛选出2条有统计学意义且靶向VDR的miRNAs:hsa-miR-326(P<0.05、FC=1.37)、hsa-miR-654-5p(P<0.05、∣LOG2FC∣=1.06).结论 通过临床样本高通量测序分析及生物信息学预测,发现了结核病中的既差异表达又靶向VDR的两条miRNAs,这两条miRNAs可能是肺结核病潜在的诊断标志及新的治疗靶点,为结核病的防治提供了新的策略和方向.

目的 通过DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)与siRNA干扰改变乳腺癌细胞MCF-7中DNA甲基化水平,探讨DNA甲基转移酶3b(Dnmt3b)表达对乳腺癌细胞相关mRNA、微小RNA(miRNA)的影响.方法 通过5-Aza-CdR抑制乳腺癌细胞整体甲基化水平,免疫荧光染色检测其抑制效果,高通量测序检测乳腺癌细胞miRNA的表达,荧光定量PCR(qRT-PCR)检测乳腺癌细胞miRNA及乳腺癌相关基因的表达;通过siRNA干扰抑制乳腺癌细胞中Dnmt3b的表达,qRT-PCR和Western blotting检测siRNA干扰效率,细胞生长曲线反映细胞生长情况.结果 5-Aza-CdR降低细胞整体甲基化水平,siRNA干扰后Dnmt3b的表达下降,细胞生长显著抑制;高通量测序显示5-Aza-CdR作用后67个miRNA表达有统计学差异(均P<0.05);qRT-PCR结果显示5-Aza-CdR作用后乳腺癌细胞中miR-200a、miR-411、miR-382、miR-409、miR-493、miR-127、miR-520a、miR-654表达显著上调(P<0.05);siRNA干扰Dnmt3b后乳腺癌细胞中miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-203b、miR-409、miR-520a、miR-654的表达显著上调(P<0.05),而miR-200b、miR-127的表达显著下调(均P<0.05);5-Aza-CdR作用后乳腺癌细胞WWOX、MMP7的表达下调,TCF21、TIMP1的表达上调(均P<0.05);siRNA干扰Dnmt3b后乳腺癌细胞抑癌基因BRCA1、BRCA2及癌基因MMP7、survivin的表达均下调(均P<0.05).结论 Dnmt3b可影响乳腺癌细胞相关基因WWOX、TCF21、BRCA1、BRCA2、MMP7、TIMP1、PKM2、survivin及miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-200b、miR-203b、miR-409、miR-127、miR-520a、miR-654的表达.

目的 探讨长链非编码RNA H19(LncRNA-H19)靶向miR-654-5p对人骨髓间充质干细胞成骨分化的促进效应.方法 选取20只SPF级5～6周龄近交系BALB/c小鼠,分离及培养骨髓间充质干细胞,采用随机数表法分为阴性对照组、LncRNA-H19转染组和LncRNA-H19抑制组,LncRNA-H19转染组转染LncRNA-H19慢病毒载体、LncRNA-H19沉默质粒.采用MTT法检测细胞增殖,测定各组碱性磷酸酶活性(ALP),荧光素报告基因实验验证LncRNA-H19靶向miR-654-5p作用,Western blot检测BMP-2、OCN蛋白表达.结果 阴性对照组、LncRNA-H19转染组和LncRNA-H19抑制组细胞培养0 h、24 h、48 h及72 h时OD值比较差异无统计学意义(P>0.05);LncRNA-H19转染组ALP活性值为(13.11±1.92)U/gprot,明显高于阴性对照组的(9.65±1.12)U/gprot和LncRNA-H19抑制组的(5.30±1.20)U/gprot,差异均有统计学意义(P<0.05);LncRNA-H19转染组miR-654-5p-3'UTR调节的荧光素酶活性为0.612±0.099,明显低于阴性对照组的1.010±0.100和LncRNA-H19抑制组的1.453±0.102,差异均有统计学意义(P<0.05);各组miR-654-5p-突变型3'UTR调节的荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05);LncRNA-H19转染组BMP-2、OCN蛋白相对量为1.102±0.102、1.242±0.088,明显高于阴性对照组的0.493±0.100、0.372±0.094和LncRNA-H19抑制组的0.202±0.082、0.182±0.092(P<0.05).结论 LncRNA-H19通过靶向miR-654-5p促进人骨髓间充质干细胞向成骨分化,可能与调控MMP-2、OCN蛋白表达有关.

已有研究证实,microRNA (miRNAs)通过调控多种基因参与肿瘤的发生和发展过程.然而,miR-654-5p通过调控宿主细胞因子1(host cell factor 1,HCFC1)抑制乳腺癌细胞侵袭转移的分子机制尚不清楚.本研究通过生物信息学数据库分析发现,miR-654-5p在乳腺癌组织中低表达,且低表达病人愈后较差(P=0.013),实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测表明,miR-654-5p在MDA-MB-231细胞中表达降低(P＜0.05),且与对照组相比,转染过表达质粒后,miR-654-5p的表达明显升高(P＜0.05).5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷(EdU)增殖实验和Transwell实验表明,过表达miR-654-5p能够抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P＜0.05).运用Cytoscape软件筛选出miR-654-5p的Hub基因HCFC1,发现miR-654-5p与HCFC1的表达呈负相关,且HCFC1在乳腺癌组织中的表达水平较高并与淋巴结转移密切相关,此外,HCFC1高表达病人的愈后较差(P=0.0039).双荧光素酶实验证实,miR-654-5p能够与HCFC1 mRNA的3 '-UTR结合(P＜0.05).Western印迹结果显示,与人正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,HCFC1在MDA-MB-231细胞中表达水平较高(P＜0.05),过表达miR-654-5p后HCFC1的表达显著下调(P＜0.05).Transwell实验结果显示,与对照组相比,过表达miR-654-5p后MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力明显下降,而共转HCFC1在一定程度上能够逆转miR-654-5p对于乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用(P＜0.05).综上所述,miR-654-5p可通过调节HCFC1的表达进而抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移.