目的 探讨血浆外泌体中与食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)发生相关的microRNAs(miRNAs),并评估其在ESCC诊断中的应用价值.方法 选取2020年3月至2021年6月山东大学第二医院胸外科收治的55例ESCC患者为ESCC组,另选取55例健康体检者为对照组,提取受试者血浆外泌体,并通过透射电镜、NanoSight粒径分析及 Western blotting进行鉴定.筛选阶段,送检对照组、ESCC组术前血浆外泌体RNA各5例进行测序.采用qRT-PCR法对训练集、验证集中差异性miRNAs分子表达进行检测,并通过受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评估差异性miRNAs分子的诊断价值.结果 测序结果显示,与对照组相比,5 个 miRNAs(miR-548k、miR-6516-5p、let-7b-3p、miR-3934-5p、miR-196a-5p)在 ESCC 组血浆外泌体中表达显著上调,8 个 miRNAs(miR-34c-5p、novel_1 67、miR-548u、miR-548ah-3p、miR-548p、miR-200a-5p、miR-200b-3p、miR-1228-5p)明显下调.通过训练队列证实,miR-548k在ESCC组血浆外泌体中明显上调(P＜0.001),血浆外泌体 miR-548k 用于 ESCC 诊断时 ROC 曲线下面积(area under curve,AUC)为 0.918,明显优于 miR-34c-5p、miR-548u、miR-6516-5p.通过验证队列进一步证实,miR-548k在ESCC组血浆外泌体中高表达(P＜0.001),血浆外泌体miR-548k可用于ESCC患者诊断(AUC值为0.889).结论 miR-548k在ESCC组血浆外泌体中表达显著增高,血浆外泌体miR-548k对ESCC诊断有一定的临床应用价值.

目的 探讨微小RNA-548ah(miRNA-548ah)调控组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)对乙型肝炎病毒(hepati-tis B virus,HBV)复制和表达的影响及其在肝组织中的表达与相关性.方法 选择2015年-2017年泰州市人民医院诊治的慢性HBV感染患者18例为研究对象,其中慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者9例,乙型肝炎肝硬化(LC)患者9例,荧光定量PCR检测三种不同肝癌细胞株及CHB患者肝组织中miRNA-548ah和HDAC4分子的表达,应用miRNA-548ah模拟剂和抑制剂转染Huh7细胞、HepG2细胞和HepG2,2,15细胞,检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的表达水平;Pearson相关分析CHB患者肝组织中miRNA548ah和HDAC4表达与临床指标的相关性.结果 miRNA-548ah和HDAC4在Huh7细胞、HepG2细胞和HepG2,2,15细胞的表达差异具有统计学意义(P<00.01);转染pHBV13.质粒的HepG2细胞、Huh7细胞、HepG2,2,15细胞中,与对照组比较,miRNA-548ah模拟剂组HBsAg、HBeAg和HBV DNA的表达均升高,miRNA-548ah抑制剂组HBsAg、HBeAg和HBV DNA表达均降低(P<00.01);CHB患者肝组织中miRNA548ah的表达为(09.0±05.6),低于乙肝LC患者的表达(16.2±07.1)(P<00.5);CHB患者肝组织中miRNA548ah和HDAC4的表达呈负相关(r=-07.46,P=00.21),肝组织中HDAC4的表达水平与血清ALT的水平呈正相关(r=07.33,P=00.25).结论 miRNA-548ah可通过靶向HDAC4调控乙型肝炎病毒的复制与表达,并且影响CHB的病情进展.

目的 构建并鉴定表达人钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(hNTCP)的HepG2-hNTCP细胞模型,探讨微小RNA-548ah(miR-548ah)对乙型肝炎病毒复制和表达的影响.方法 扩增重组慢病毒pWPI-hNTCP-Puro质粒,pWPI-hNTCP-Puro慢病毒感染HepG2细胞,聚合酶链反应(PCR)检测hNTCPmRNA的表达水平,共聚焦显微镜检测hNTCP蛋白定位.Lipofectamine转染miR-548ah激动剂、miR-548ah抑制剂及阴性对照至细胞系.酶联免疫吸附测定检测HBsAg和HBeAg的表达水平,荧光定量PCR检测HBVDNA的表达,应用SPSS 17.0对数据进行分析.结果 hNTCP mRNA在HepG2hNTCP呈高水平表达.共聚焦荧光显微镜观察HepG2hNTCP中的hNTCP蛋白正常表达且主要定位在细胞膜上.与HepG2细胞比较,HBsAg和HBeAg在感染后HepG2-hNTCP细胞5天和7天后的表达水平存在差异,随培养天数呈上升趋势,具有统计学意义(P＜0.01).与转染阴性对照比较,HBsAg在转染miR-548ah激动剂组的表达水平升高,差异具有统计学意义(P＜0.05);而HBeAg和HBVDNA的表达水平无明显变化,差异均无统计学意义.结论 成功构建了表达hNTCP的HepG2-hNTCP细胞模型,对乙型肝炎病毒感染具有良好的易感性;miR-548ah可促进HBV感染HepG2-hNTCP细胞模型中HBsAg的表达.

目的:探讨血液miRNA-548ah在慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染不同时期的表达，并分析其临床价值。方法:选取2015年1月至2019年1月恩施土家族苗族自治州中心医院收治的108例慢性HBV感染者为研究对象（HBV感染组），根据分期不同将108例患者分为免疫耐受期组（32例）、免疫清除期组（28例）、低复制期组（25例）和再活动期组（23例）；另外选取同期100例健康体检者为对照组。采用采用Exo Quick试剂盒提取血液外泌体，并采用Western blot蛋白质印记法验证外泌体的真实性；采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测血液外泌体中miRNA-548ah水平，并收集其血清HBV DNA和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平。比较HBV感染组患者和对照组血液外泌体miRNA-548ah差异，并绘制ROC曲线探讨血液外泌体miRNA-548ah在慢性HBV感染不同时期中的应用价值，采用Pearson相关法分析血液外泌体miRNA-548ah与HBV DNA和ALT的关系。结果:蛋白质免疫印迹法检测外泌体表面特异性标志物CD63和Tsg101蛋白阳性，提示外泌体提取成功。HBV感染组和对照组血液外泌体miRNA-548ah水平分别为（3.46 ± 0.83）和（0.72 ± 0.15），差异有统计学意义（t = 32.518、P < 0.001）；ROC曲线分析显示，外泌体miRNA-548ah在慢性HBV感染诊断中具有一定价值（AUC = 0.785、95%CI：0.723~0.877、截断值：1.04、敏感性为84.5%、特异度为82.6%）。免疫耐受期组、免疫清除期组、低复制期组和再活动期组血液外泌体miRNA-548ah分别为（4.18 ± 1.34）、（1.41 ± 0.45）、（1.32 ± 0.31）和（1.48 ± 0.42），差异有统计学意义（F = 27.435、P < 0.001）；其中免疫耐受期组和免疫清除期组患者差异有统计学意义（t = 10.427、P < 0.001），免疫清除期组和低复制期组患者差异无统计学意义（t = 0.838、P = 0.406）；低复制期组和再活动期组差异无统计学意义（t = 1.510、P = 0.138）。Pearson相关分析表明，HBV感染免疫耐受期miRNA-548ah与HBV DNA、ALT均呈显著正相关（r = 0.857、P < 0.001，r = 0.763、P < 0.001）；HBV感染再活动期患者miRNA-548ah与HBV DNA、ALT均呈显著正相关（r = 0.776、P = 0.001，r = 0.711、P = 0.001）；HBV感染免疫清除期miRNA-548ah与HBV DNA、ALT呈正相关，但相关性不显著（r = 0.572、P = 0.035，r = 0.531、P = 0.042）；HBV感染低复制期miRNA-548ah与HBV DNA、ALT呈正相关，但相关性不显著（r = 0.541、P = 0.039，r = 0.502、P = 0.048）。结论:血液外泌体miRNA-548ah在慢性HBV感染者高表达，有望成为诊断慢性HBV感染的新型标志物，且其在HBV感染自然史不同阶段的表达存在差异，与血清HBV DNA和ALT亦相关，可用于指导临床用药并进行及时调整。