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核糖核酸酶RnaseⅢ rncS基因缺失对单核细胞增生李斯特菌环境应激的调控作用研究
编辑人员丨2023/8/6
目的 了解核糖核酸酶RnaseⅢ rncS基因缺失对单核细胞增生李斯特菌(LM)环境应激和生物被膜形成的影响. 方法 以LM SB5强毒株为对象,利用温度敏感型穿梭质粒pKSV7,通过基因重叠延伸PCR (SOE-PCR)和同源重组技术构建LM-△rncS基因缺失突变株,检测其在不同温度、pH、高盐、乙醇、H2O2胁迫环境下的适应能力,通过结晶紫染色法检测生物被膜的形成能力. 结果 与LM-SB5株相比,构建的LM-△rncS在37℃、pH 4及pH 7的环境适应能力无显著变化(P＞0.05),而在30℃、42℃、pH 9、5％NaCl、3.8％乙醇、0.1％ H2O2的应激环境下其适应能力及生物被膜的形成能力显著降低(P＜0.05),提示Rnase Ⅲ RncS参与了LM对低温、高温、碱、高盐、乙醇及H2O2胁迫环境的适应过程及生物被膜形成的调控. 结论 构建的LM-△rncS基因缺失突变株,在不同应激环境下的适应能力及生物被膜形成能力均显著降低,为RnaseⅢ RncS参与LM ncRNA调控环境应激的分子机制研究奠定了基础.
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编辑人员丨2023/8/6
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单增李斯特菌核糖核酸酶Rnase Ⅲ RncS氨基酸突变对其降解RNA活性的影响
编辑人员丨2023/8/6
为研究单增李斯特菌(LM)核糖核酸酶RnaseⅢRncS氨基酸突变对RNA降解活性的影响.利用生物信息学软件分析单核细胞增生李斯特菌(LM)野毒株SB5中rncS基因编码的RnaseⅢ的结构域,并选择关键氨基酸利用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术对其进行了基因突变;然后将rncS突变基因片段D50A、E122A克隆至表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达;应用SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况及其抗原特异性;通过体外酶活试验研究其对RNA降解活性的影响.结构域分析结果显示,LM-RnaseⅢ氨基酸序列含有1个双链RNA结合结构域(DSRM)和1个核酸酶结构域(RIBOc),其中结构域RIBOc含有5个活性位点.SDS-PAGE检测结果显示,表达的重组突变型RnaseⅢ-D50A和RnaseⅢ-E122 A蛋白相对分子质量均为42.5 kD,与理论值相符;Western blot分析表明重组突变型RnaseⅢ-1)50A和RnaseⅢ-E122A蛋白可与LM阳性血清发生免疫学反应.体外酶活实验表明,RnaseⅢ发挥降解活性依赖于Mn2+或Mg2+,将其第50位天冬氨酸突变后,RnaseⅢRncS的降解活性有所降低(P＜0.001);第122位谷氨酸突变后,RnaseⅢRncS降解活性极显著下降(P＜0.0001),提示第122位谷氨酸是维持LM RnaseⅢRncS酶活性的关键位点.
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编辑人员丨2023/8/6
