目的 探讨病毒拟似物对人卵巢颗粒细胞病毒反应蛋白表达的影响,明确颗粒细胞在卵巢病毒感染时的反应.方法 将原代培养的人卵巢颗粒细胞分为对照组、病毒拟似物Poly(I:C)处理组、卵泡刺激素(FSH)处理组.CCK8法测定细胞增殖活力、real-time PCR法测定干扰素-β(IFN-β)、viperin mRNA表达,Western blot法测定viperin蛋白表达.结果 原代接种培养5 d后,FSH可诱导颗粒细胞增殖(P<0.05),Poly(I:C)10μg/mL对细胞增殖活力无显著影响.Poly(I:C)刺激后24 h内诱导IFN-β、viperin mRNA表达明显上调,其中IFN-β于刺激后2 h表达水平达到峰值(P<0.05),viperin于刺激后8 h达到峰值(P<0.05),刺激后24 h,两者mRNA表达水平均回归刺激前水平.Poly(I:C)诱导颗粒细胞viperin蛋白表达,水平随Poly(I:C)浓度上升.结论 病毒拟似物能够诱导颗粒细胞表达病毒反应蛋白viperin.

在脊椎动物中viperin已被证明是一种能抵御大多数DNA和RNA病毒的抗病毒蛋白质.本文克隆及鉴定了青鱼viperin.青鱼viperin (bc Viperin) 的c DNA由1 828个核苷酸组成, 编码360个氨基酸.预测的bc Viperin蛋白包含N端低保守的两性α-螺旋结构域、中间自由基S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosylmethionine, SAM) 结构域及高保守C端结构域.bc Viperin m RNA在青鱼心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、肌肉、皮肤和鳃等组织中均有表达.在草鱼呼肠孤病毒 (grass carp reovirus, GCRV) 和鲤春病毒血症病毒 (spring viremia of carp virus, SVCV) 感染后, bc Viperin m RNA在上述组织中的表达水平提高.在青鱼尾鳍 (Mylopharyngodon piceus fin, MPF) 细胞中, bc Viperin m RNA表达水平同样会在GCRV和SVCV感染后发生上升.蛋白质免疫印迹表明bc Viperin蛋白的相对分子质量约为42 k D;He La和EPC细胞中的免疫荧光染色实验表明bc Viperin是细胞质蛋白.编码bc Viperin的质粒在EPC细胞中过表达后能够显著提高细胞抵御SVCV和GCRV的抗病毒能力.以上研究表明bc Viperin是青鱼天然免疫过程中重要的抗病毒蛋白质.

目的 探索鸭抗病毒白(viperin)对鸭坦布苏病毒(DTMUV)增殖的影响.方法 使用生物学信息学方法分析鸭viperin基因,构建系统发育树.构建原核表达质粒pGEX-6P-viperin和真核表达质粒pEGFP-N1-viperin,分别转化Rosseta感受态细胞和转染BHK-21细胞.用DTMUV分别感染真核表达质粒和空载体质粒的BHK-21细胞,利用实时荧光定量PCR检测细胞沉淀和上清中DTMUV的含量,利用质谱的方法鉴定增强型绿色荧光蛋白(EGFP)单克隆抗体捕获的结合蛋白.结果 鸭viperin基因与其他种属viperin基因有显著差异.鸭viperin蛋白能成功在BHK-21细胞表达,鸭viperin抑制DTMUV在BHK-21细胞中的出芽.质谱分析结果显示转染真核表达质粒的细胞中可能存在6种影响抑制DTMUV增殖、出芽的蛋白.结论 鸭viperin蛋白可在BHK-21细胞表达,且能抑制鸭坦布苏病毒出芽.

Viperin是近年来发现的具有重要免疫活性的宿主蛋白之一,其在细胞内的表达在病毒感染或干扰素诱导后明显上升,显示出广泛的抗病毒活性.已证实它可以影响许多囊膜病毒在宿主细胞中的组装和释放,但在不同的病毒中所表现的具体抗病毒活性不同.黄病毒属病毒为单股正链具囊膜的RNA病毒,该种属病毒具有相似的结构特征.Viperin蛋白可以抑制多数黄病毒在细胞中的复制.就Viperin抗几种黄病毒属病毒作用机制进行综述,为相关研究提供参考.

旨在探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)cured细胞株的易感机制.本研究将体外转录的HCV RNA电转入肝癌细胞系Huh 7细胞,建立HCV复制子细胞株,用γ-干扰素(interferon,IFN)处理复制子细胞株,获得HCV cured Huh 7A和Huh 7B细胞株.用插入报告基因的HCV毒株Jc1-G感染上述细胞株,分别进行荧光素酶活性测定、蛋白质印迹法和荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测以验证其易感性.收集Huh 7、Huh 7.5、Huh 7A和Huh 7B细胞并利用IFN-α处理,之后用蛋白质印迹法及荧光定量PCR进行检测,验证细胞株中IFN诱生信号通路中关键因子内源性表达及抗病毒活性ISGs的激活水平.结果显示,在Huh 7A和Huh 7B细胞中检测不到病毒RNA,与Huh 7细胞一致.病毒感染实验中,与Huh 7细胞相比,Huh 7A和Huh 7B细胞株中荧光素酶活性增高百倍,病毒蛋白表达和RNA水平亦显著上调,与Huh 7.5细胞株中的表达水平接近.IFN信号通路实验中,与Huh 7细胞相比,Huh 7A和Huh 7B细胞株中RIG-I/MDA5/MAVS内源性蛋白表达和mRNA水平无明显差异;IFN-α处理细胞后IFN刺激基因isg56,mx1,mx2,oax1,oax2,viperin,cxcl10,ifitm1和ifitm3激活水平亦无显著变化.结果提示,本研究制备的Huh 7A和Huh 7B细胞株可支持HCV高水平复制,将为研究病毒复制机制提供有力的支持.

Viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV),belonging to the genus Novirhabdovirus,Rhabdoviridae family,is a causative agent of high mortality in fish and has caused significant losses to the aquaculture industry.Currently,no effective vaccines,Food and Drug Administration-approved inhibitors,or other therapeutic intervention options are available against VHSV.α-Lipoic Acid (LA),a potent antioxidant,has been proposed to have antiviral effects against different viruses.In this study,LA (CC50 =472.6 μmol/L) was repurposed to exhibit antiviral activity against VHSV.In fathead minnow cells,LA significantly increased the cell viability post-VHSV infection (ECso =42.7 μmol/L),and exerted a dose-dependent inhibitory effect on VHSV induced-plaque,cytopathic effects,and VHSV glycoprotein expression.The time-of-addition assay suggested that the antiviral activity of LA occurred at viral replication stage.Survival assay revealed that LA could significantly upregulated the survival rate of VHSV-infected largemouth bass in both co-injection (38.095％ vs.1.887％,P ＜ 0.01) and post-injection manner (38.813％ vs.8.696％,P ＜ 0.01) compared with the control group.Additional comparative transcriptome and qRT-PCR analysis revealed LA treatment upregulated the expression of several antiviral genes,such as IRF7,Viperin,and ISG15.Moreover,LA treatment reduced VHSV-induced reactive oxygen species production in addition to Nrf2 and SOD1 expression.Taken together,these data demonstrated that LA suppressed VHSV replication by inducing antiviral genes expression and reducing VHSV-induced oxidative stress.These results suggest a new direction in the development of potential antiviral candidate drugs against VHSV infection.

干扰素诱导的内质网相关抑制病毒蛋白(Viperin)是一种常见的干扰素诱导蛋白,可抑制多种病毒的增殖.研究证实Viperin是一种多功能的、膜靶向的抗病毒蛋白,其每个结构域都扮演着不同的病毒特异性角色.此外其表达不仅局限于依赖干扰素通路调控,还具有鲜明的多样性来源特征.有趣的是,Viperin还可被多种被病毒利用来促进病毒自身的增殖.为更好的了解其功能,本文从Viperin的结构特征、产生机制、抑制病毒复制和促进病毒复制等方面最新的研究进展进行综述.

目的 以纯化的内质网相关的干扰素诱导病毒抑制蛋白(viperin)免疫小鼠制备其多克隆抗体并鉴定其特异性.方法 对BALB/c小鼠颅内注射鸭坦布苏病毒,刺激小鼠脑组织产生viperin,通过反转录PCR从小鼠大脑组织克隆viperin,并将其插入至pGEX-6P-1原核表达载体,转化至大肠杆菌Rosetta.用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对重组蛋白诱导表达,对其进行可溶性分析,以氯化钾染色切胶法对大量表达蛋白进行纯化;将纯化的重组viperin蛋白经腹部皮下免疫小鼠制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定多抗效价,Western blot法和间接免疫荧光法(IFA)检测BHK-21仓鼠肾成纤维细胞瞬时表达的viperin蛋白鉴定viperin抗体的特异性和敏感性.结果 成功克隆并表达小鼠viperin基因,制备的抗体效价可达1∶25 600,小鼠抗viperin多克隆抗体可特异性识别BHK-21细胞表达的viperin蛋白.结论 成功制备特异性较好的小鼠抗viperin多克隆抗体.