[目的]探索大肠杆菌(E.coli)菌种复苏后跳过三角摇瓶直接接种一次性WAVE生物反应器进行菌种扩增,并放大至一次性XDR生物反应器进行质粒放大生产的可行性,建立GMP级质粒在全一次性上游平台进行工业化放大生产的工艺.[方法]通过碳氮比优化,筛选并获得不含任何动物源成分的基础培养基和补料培养基;菌种冻存管室温融化后以低密度接种三角摇瓶和WAVE反应器,考查菌种低密度接种的可行性,比较三角摇瓶和WAVE反应器进行菌种扩增的差异,建立菌种在WAVE反应器中的扩增工艺;随后将菌种扩增至 50 L XDR生物反应器进行质粒的放大生产.[结果]与LB培养基相比,优化的不含任何动物源成分的基础培养基使菌体最高密度和质粒产量分别提高 43%和 77%;以 1∶1 000-1∶8 000 低密度接种WAVE反应器,菌种比生长速率达到(0.65±0.065)/h,WAVE反应器展现了更好的过程参数控制,通过一级WAVE种子罐可直接为 50-200 L生产罐提供种子细胞;质粒在一次性50 L XDR反应器中的放大生产,最高菌体密度和质粒产量分别达到53 OD和340 mg/L,质粒比生产速率达到6.42 mg/L/OD600,比常规质粒比生产速率提高 2 倍以上,超螺旋质粒比例达到 90%,较高的上游收获超螺旋比例为下游质粒两步层析纯化提供了可能.[结论]建立了大肠杆菌通过WAVE反应器进行菌种扩增,通过一级种子罐直接接种生产罐进行质粒放大生产的工艺,为GMP级别质粒在 50-200 L一次性生产平台中的放大生产建立了生产工艺.

抗体药物生产一般先由哺乳动物细胞表达并分泌活性物质于细胞外,通过澄清步骤分离细胞(碎片)及其他不溶性颗粒并收获澄清液,然后运用多步柱层析捕获和精纯抗体[1].澄清步骤通常通过多级深层过滤或离心后单级深层过滤这两种手段实现[2].深层过滤需要使用一次性深层过滤膜包耗材,而离心需要采购和维护离心机设备,因此需要综合考虑耗材设备费用及厂房利用率以选择合适的工艺.当生物反应器规模 ≤ 2000 L 时,多级深层过滤工艺因成本更低而被广泛应用[3].

基因治疗是一个快速发展的领域,其中关于慢病毒介导的外源基因导入研究得最为广泛.随着研发技术的不断发展,在安全性方面慢病毒已经从第一代发展至第三代,而如何工程化获得高滴度慢病毒仍是当今技术一大瓶颈.运用Fibra-Cel片状载体作为HEK293T细胞载体基质,联合多个无菌细胞转瓶在滚瓶机上培养,对贴壁细胞进行规模放大化生产.通过对第三代慢病毒包装过程中影响慢病毒滴度的因素进行逐一筛选,使病毒滴度达到最优.研究结果成功运用Fibra-Cel片状载体作为HEK293T细胞粘附载体基质,作为一种贴壁细胞规模放大的方法,筛选出了利用滚瓶机制备第三代慢病毒的最优条件,规模化生产了3批慢病毒.在时间上,将慢病毒的生产时间从质粒转染到病毒收集的120 h缩短至54 h;在成本上,利用滚瓶机代替生物反应器实现了无需反复灭菌、全程一次性产品的安全有效低成本的运行,为慢病毒的规模化制备提供了技术上的支持,为临床应用奠定了坚实的基础.

通过中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)表达系统制备人血清白蛋白(Human serum albu-min,HSA),为HSA及其融合蛋白质药物的制备及功能研究提供依据.首先构建含有目的基因的重组表达质粒pMH3-HSA,通过有限稀释法和Dot blot检测筛选阳性单克隆,随后扩大培养并悬浮驯化,然后运用5 L一次性生物反应器进行高密度放大培养,以无血清培养基B001和F001分别作为基础和流加培养基,以55 r/min、DO 20％ ～40％、pH 6.8～7.4、Tm 37℃为基础参数进行发酵控制,通过细胞计数、SDS-PAGE、Elisa、Western Blot等实验方法,检测发酵过程中的细胞生长状态以及目标蛋白HSA的表达情况,同时与毕赤酵母表达系统制备的HSA进行比较.结果表明:1)成功构建并筛选出了含外源HSA基因的高表达单克隆CHO细胞株;2)在5 L一次性生物反应器中进行流加培养,HSA的最高产量达180μg/mL;3)CHO表达系统产物几乎无降解.综合表明HSA蛋白更适合在CHO系统中进行表达,其蛋白完整性优势在该系统中表现得尤为明显.

微小型生物反应器体积微小但在线分析检测和过程控制功能媲美台式装备.其核心支撑技术包括一次性材料及微加工技术、非接触式光学传感器、自动化以及实验设计(DOE)、数据分析软件与过程控制的整合.由于体积微小、湍流程度和单位能耗较低,微小型反应器内的混合、传质、剪切特性与工业规模设备有一定的区别.现阶段微小型生物反应器主要用于菌株和细胞系筛选和工艺优化,在实现高通量工艺的同时确保了数据的丰度,对缩短研发周期和加速产品上市,尤其是在应对突发性传染性疾病方面有着重要的意义.未来,精准医疗概念的落实也依赖功能柔性化的微小型生物反应器系统.

[目的]将购自ATCC的ST贴壁细胞通过自主驯化,使其能在甘肃健顺生物科技有限公司(简称健顺生物)自产的无血清培养基CD ST 258中悬浮生长且能稳定传代,在反应器中能高密度生长.[方法]采用高血清贴壁培养转无血清悬浮培养;单因素实验优化氨基酸、维生素、无机盐等培养基组分;单因素实验优化生物反应器的pH、溶氧和转速三个参数.[结果]悬浮细胞在无血清培养基中传代,72 h细胞密度高于8.0 ×106 cells/mL;反应器中细胞最高生长密度可达3.0 × 107 cells/mL.[结论]ST贴壁细胞可驯化为悬浮细胞,能在无血清培养基中稳定传代且在一次性反应器中可高密度生长.