鱼类的许多生理过程都受到烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors)的调节,如神经肌肉信号传递.在海洋环境中,三带双锯鱼(Amphiprion ocellaris)被芋螺(Conus)捕食的过程与烟碱型乙酰胆碱受体密切相关.本研究以三带双锯鱼肌肉、脑、肠道组织的cDNA作为模板,克隆三带双锯鱼烟碱型乙酰胆碱受体不同亚基的基因,在此基础上进行生物信息学分析,同时构建系统进化树.研究结果表明,从三带双锯鱼肌肉组织中克隆得到了烟碱型胆碱能受体α1亚基(cho-linergic receptor nicotinic alpha 1 subunit,chrna1)和烟碱型胆碱能受体 e 亚基(cholinergic receptor nicotinic epsilon subunit,chrne)基因序列;从脑组织中克隆获得烟碱型胆碱能受体α10亚基(cholinergic receptor nicotinic alpha 10 subunit,chrna10)基因序列.将得到的基因序列利用Colabfold软件对其编码蛋白的3D结构进行预测,所得结果与已经解析的烟碱型乙酰胆碱受体的结构高度相似.采用荧光定量PCR技术对chrna1、chrne、chrna10基因在三带双锯鱼肌肉、脑、肠组织中的表达水平进行检测,结果显示,chrna1、chrne基因在肌肉组织中的表达量非常高,在脑组织中的表达量非常低,肠道组织中没有检测到表达.chrna10基因在脑组织中的表达量较低,在肌肉、肠道组织中没有检测到表达.系统进化树结果表明不同物种间乙酰胆碱受体的蛋白序列高度保守,三带双锯鱼与模式生物斑马鱼(Danio rerio)几乎同源.

目的:应用CHO细胞表达系统表达重组水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)gE Δ-Fc融合蛋白，为筛选重组带状疱疹疫苗候选抗原提供参考。 方法:将含有编码gE Δ-Fc基因的真核表达质粒转染CHO细胞，经MSX加压筛选和有限稀释法挑选单克隆，获得分泌表达gE Δ-Fc融合蛋白的CHO细胞株。MabSelect SuRe亲和层析纯化gE Δ-Fc融合蛋白，ELISA法对gE Δ-Fc融合蛋白与Fc受体结合进行鉴定，流式细胞术检测DC2.4细胞对抗原的吞噬效果。gE Δ-Fc融合蛋白免疫BALB/c小鼠后，ELISA法检测小鼠血清抗体效价。 结果:获得表达gE Δ-Fc融合蛋白的CHO细胞株；流式细胞术证明DC2.4细胞对gE Δ-Fc融合蛋白的吞噬强于gE；gE Δ-Fc融合蛋白可以诱导BALB/c小鼠产生高滴度的抗VZV抗体。 结论:应用CHO细胞表达的重组VZV gE Δ-Fc融合蛋白具有较好的免疫原性。本研究为筛选重组带状疱疹疫苗候选抗原提供了数据支持。

目的:建立用于人呼吸道合胞病毒（HRSV）中和抗体滴度检测的噬斑减少中和实验（PRNT），并进行条件优化与初步应用。方法:应用CHO表达系统制备帕利珠单克隆抗体（Palivizumab），同时对细胞种类、细胞培养时间、固定通透方法、封闭方法等影响因素进行优化。验证该方法的重复性，并与传统PRNT验证其相关性。利用优化的PRNT方法检测BALB/c小鼠血清（融合蛋白肌肉注射免疫）对HRSV A和B亚型的中和抗体滴度。结果:Palivizumab的表达量约为50 mg/L。PRNT的最佳工作条件为：培养细胞为HEp-2细胞，细胞培养时间为2 d，最佳固定通透方式为4%（V/V）多聚甲醛室温固定15 min后0.2%（V/V）Triton X-100通透15 min，去掉封闭步骤。优化后该方法的重复性验证总体变异系数均<15%，与传统PRNT呈现良好的线性关系，Spearman相关系数 r s高达0.983。在检测小鼠血清对HRSV A亚型long株和B亚型9320株的中和抗体滴度时，融合蛋白联合AlOH和CpG佐剂诱导小鼠产生的中和抗体滴度最高。 结论:本研究建立的HRSV中和抗体检测方法快速、可重复、高通量，能够适用于A、B亚型HRSV的中和抗体检测。

目的:构建一种新的靶向CD123抗原的双特异性抗体（CD123 DuAb），研究CD123DuAb在急性髓系白血病（AML）治疗中的作用。方法:以自主研发的CD123单克隆抗体可变区为基础，利用分子克隆技术，构建CD123 DuAb表达质粒，转染ExpiCHO-S细胞，表达该双功能抗体。通过功能实验，验证CD123 DuAb在T细胞活化及增殖中的作用，及其促进T细胞对AML细胞的杀伤作用。结果:①构建了CD123 DuAb表达质粒，并通过Expi-CHO真核系统表达。②CD123 DuAb可以分别与T细胞上的CD3位点及CD123阳性肿瘤细胞上的CD123位点结合。③将1 nmol/L CD123 DuAb加入T细胞与MV4-11细胞共培养体系中，T细胞中CD69阳性表达率为68.0%，CD25阳性表达率为44.3%，均显著高于对照组（ P值均<0.05）。④在CD123 DuAb浓度为1 nmol/L的条件下培养T细胞，可促进T细胞增殖，其绝对计数第1天为5×10 5/ml，第9天扩增至3.2×10 6/ml，且CFSE荧光强度显著降低。⑤CD123 DuAb能够显著激活T细胞，且激活强度与其浓度呈正相关，浓度为1 nmol/L时，T细胞CD107a表达率可达16.05%，较对照组显著升高（ P<0.05）。⑥随培养体系中CD123 DuAb浓度的升高，T细胞耗竭和凋亡也随之增加，浓度为1 nmol/L时，T细胞CD8 +PD-1 +LAG-3 +比例为10.90%，PI -Annexin Ⅴ +比例为18.27%，PI +Annexin Ⅴ +比例为11.43%，均较对照组显著升高（ P<0.05）。⑦CD123 DuAb能够促进T细胞分泌细胞因子，浓度为1 nmol/L时，共培养体系上清中的IFN-γ和TNF-α的浓度可分别达到193.8 pg/ml和169.8 pg/ml，较对照组显著升高（ P<0.05）。⑧将CD123 DuAb以1 nmol/L的浓度加入T细胞与CD123阳性肿瘤细胞共培养体系中，能显著增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，共培养3 d，CD123 +MV4-11细胞、CD123 +Molm13细胞和CD123 +THP-1细胞的残留率分别为7.4%、6.7%和14.6%，较对照组显著降低（ P<0.05）。 结论:本研究构建及表达了一种靶向CD123的双特异性抗体，并通过体外实验验证其可以同时结合CD123阳性肿瘤细胞和T细胞，促进T细胞的活化和增殖，增强其抗白血病作用，为进一步临床研究提供了基础。

目的 通过无血清悬浮驯化CHO-K1细胞,筛选出单克隆源性可追溯、生长状态良好的宿主细胞株,并进行表达验证.方法 采用逐步降低血清含量的方法,将贴壁状态的CHO-K1细胞驯化成适应无血清培养基培养的悬浮细胞;通过单细胞接种/成像系统Verified In-Situ Plate Seeding(简称VIPS系统)筛选单克隆,经连续培养综合评估单克隆细胞的倍增时间、结团率、细胞直径等参数,确定候选克隆;将候选克隆分别转染携带绿色及红色荧光蛋白的质粒,根据荧光蛋白表达情况确定1株克隆作为工程细胞株的宿主细胞.结果 驯化获得的CHO-K1细胞适应无血清悬浮培养,倍增时间为20～24 h;通过单克隆筛选和产量评估确定的单克隆细胞株单克隆源性良好且可追溯,以0.5 × 106个/mL的细胞密度接种,培养7 d最高细胞密度可达8.27 × 106个/mL,活率不低于80％,平均倍增时间20.31h,能较好地表达外源基因.结论 通过无血清驯化培养,成功获得单克隆源性可追溯、生长状态良好且能够用于蛋白高表达的CHO-K1细胞株.

为揭示不同链长和不饱和度的脂肪酸对水产动物生长、脂代谢和非特异性免疫的影响,研究挑选初始体重为(8.00±0.20)g的大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)幼鱼作为实验对象,设置了添加不同链长和不饱和度脂肪酸的8种等氮等脂配合饲料:对照组(CON)、棕榈酸组(PA)、硬脂酸组(SA)、油酸组(OA)、亚油酸组(LA)、亚麻酸组(ALA)、花生四烯酸组(ARA)和二十二碳六烯酸/二十碳五烯酸组(DHA/EPA),在18℃的循环水养殖系统中进行为期8周的养殖实验.结果表明:随着饲料中添加脂肪酸链长和不饱和度的增加,大菱鲆幼鱼增重率(WGR)、特定生长率(SGR)和蛋白质效率(PER)均有增高的趋势,ARA组WGR和SGR最高,DHA/EPA组PER最高.饲料中添加不同脂肪酸对大菱鲆幼鱼鱼体的灰分和水分没有显著性影响(P＞0.05),但鱼体的粗蛋白含量随着脂肪酸链长和不饱和度的增加而增加,粗脂肪含量随着脂肪酸链长和不饱和度的增加而降低.随着脂肪酸链长和不饱和度的增加,大菱鲆幼鱼血浆胆固醇(T-CHO)含量逐渐降低,而血浆甘油三酯(TG)含量在SA组最高,在DHA/EPA组最低;血浆低密度脂蛋白(LDL-C)含量随着添加脂肪酸链长和不饱和度的增加而降低,高密度脂蛋白(HDL-C)呈相反的趋势.进一步对大菱鲆肝脏脂代谢相关基因检测得出,饲料中添加不同脂肪酸可以通过调控脂代谢相关基因表达(FAS、PPARy、SREBP1、PPARα和ACOX1)进而控制大菱鲆幼鱼鱼体的脂肪合成和分解.PA组的肝脏总抗氧化能力(T-AOC)最低,且显著低于其他各处理组(P＜0.05).DHA/EPA组的肝脏超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)含量最高,肝脏丙二醛(MDA)含量最低.进一步对肝脏免疫基因定量得出,PA、SA组显著提高了促炎因子(IL-1β、IL-8、MyD88、NF-κBp65、TLR2、TLR8、TLR9和TNF-α)的基因表达量,且显著降低了抗炎因子的表达量(TGF-β),而LA、ALA、ARA和DHA/EPA组则呈现出相反的趋势.研究结果表明,随着饲料中添加脂肪酸链长和不饱和度的增加,可以显著影响大菱鲆幼鱼的生长、脂代谢和非特异性免疫.

为研究雷公藤甲素(triptolide,TP)对Ⅱ型胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)雌性大鼠生殖系统的毒性作用及机制,将 50 只SD大鼠随机分为正常组(Con),模型组(CIA),雷公藤片临床等效剂量 0.5、1、2 倍组(含雷公藤甲素3.75、7.5、15 μg·kg-1·d-1),每组 10 只,首次免疫后当日开始灌胃给药,每天 1 次,给药 42 d.分别于第 21、42 天取材,计算子宫和卵巢脏器指数;显微镜下观察子宫和卵巢组织病理形态学变化;ELISA法检测卵巢组织匀浆中雌二醇(estradiol,E2)及细胞色素P450A1(aromatase,CYP19A1)水平;免疫组织化学法检测卵巢组织中通路相关蛋白转化生长因子 β3(transforming growth factor β3,TGFβ3)、细胞信号传导分子 3(mothers against decapentaplegic homolog 3,Smad3)及肾上腺核受体 1(steroido-genic factor-1,SF-1)表达水平.并在体外建立中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞系,经TP给药(30、60、120 nmol·L-1)24 h后MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测细胞中TGFβ3、Smad3 及SF-1蛋白表达,并通过免疫荧光检测SF-1因子入核情况.结果表明,与模型组比较,TP各给药组在给药21、42 d子宫腺体数、总卵泡数、成熟卵泡数、黄体数均有降低趋势,但差异并无统计学意义,仅 2 倍TP在给药 42 d时可显著增加闭锁卵泡数;TP 3.75 μg·kg-1·d-1在给药 21 d 即可显著降低 E2 水平,但对雌激素合成限速酶 CYP19A1 无显著影响,但可显著降低卵巢组织TGFβ3、Smad3 因子表达,且无论给药 21 d还是 42 d,TP 7.5、15 μg·kg-1·d-1均显著降低SF-1 因子表达.TP可显著促进体外卵巢细胞凋亡,给药 24 h后,凋亡主要集中在凋亡晚期;且 60 nmol·L-1 TP即可显著降低TGFβ3、Smad3 及SF-1 蛋白表达,并呈剂量依赖性.综上所述,2 倍以下临床等效剂量的TP灌胃 21、42 d并未引起CIA大鼠子宫、卵巢组织明显的生殖损伤,仅在 2 倍临床等效剂量给药 42 d时,闭锁卵泡数发生显著变化.TP通过抑制TGFβ3/Smad3/SF-1 通路表达发挥体内生殖靶器官及体外卵巢细胞生殖毒性作用.

目的:为解决野生型B细胞成熟抗原(BCMA)被γ分泌酶切割导致表达不稳定的问题,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体并构建靶细胞,用于评价BCMA CAR-T细胞的杀伤功能.方法:将野生型BCMA的穿膜域替换为人CD8α穿膜域,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体(BCMA-CD8α TM),构建过表达该突变体的U266(U266BCMA Mut)、K562(K562BCMA Mut)、SKOV3(SKOV3BCMA Mut)和CHO(CHOBCMA Mut)细胞;构建装载NFAT-EGFP报告基因的BCMA CAR Jurkat细胞(BCMA-CAR-Jurkat-Reporter)与U266BCMA Mut细胞共培养,采用FCM检测该细胞中EGFP表达水平以指示NFAT激活水平,荧光素酶法检测BCMA CAR-T细胞对Luciferase标记的K562BCMA Mut细胞的杀伤作用,实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)检测BCMA CAR-T细胞对SKOV3BCMA Mut和CHOBCMA Mut细胞的杀伤作用.结果:应用γ分泌酶抑制剂LY411575抑制γ分泌酶活性,显著增强野生型U266细胞表面BCMA表达水平,平均荧光强度上调10倍以上;但撤除抑制剂后BCMA表达水平逐渐降低(P<0.01);BCMA-CD8α TM突变体可抵抗γ分泌酶的切割作用,在U266细胞表面稳定表达(P>0.05);U266细胞及过表达BCMA-CD8α TM的U266细胞与BCMA-CAR-Jurkat-Reporter细胞共培养后都可激活Reporter系统、增强EGFP表达,但该效应在BCMA-CD8α TM过表达的U266细胞中更显著(P<0.01);BCMA-CD8α TM在BCMA表达阴性的K562、SKOV3和CHO 3种靶细胞中成功过表达,且在LY411575处理下该突变体的表达水平仅有小幅度升高;荧光素酶法检测结果显示,不同效靶比下,BCMA CAR-T细胞均可特异、高效杀伤过表达BCMA-CD8α TM的K562细胞;RTCA结果显示,不同效靶比下,BCMA CAR-T细胞均可有效识别、杀伤过表达BCMA-CD8α TM的SKOV3和CHO细胞,但同等效靶比下的Mock-T细胞无此效应.结论:本实验构建的BCMA-CD8α TM突变体能够抵抗γ分泌酶的切割,在多种靶细胞表面稳定表达,为评价BCMA CAR-T细胞体外杀伤的有效性和特异性提供多种检测手段.

目的:系统评价大黄素对糖尿病肾病动物肾脏的保护作用.方法:计算机检索中国知网、维普、万方、中国生物医学文献及PubMed等数据库,检索从建库至2023年2月25日关于大黄素治疗糖尿病肾病的动物实验.采用RevMan 5.4.1软件进行分析.结果:共纳入14个研究,结果显示,相比于对照组,大黄素组更能降低糖尿病动物血糖[SMD=-2.51,95%CI(-3.77,-1.24),I2=89%]、肌酐[SMD=-3.05,95%CI(-4.75,-1.34),I2=91%]、尿素氮[SMD=-2.69,95%CI(-3.88,-1.50),I2=82%]、24 h尿蛋白定量[SMD=-3.35,95%CI(-4.85,-1.85),I2=87%]、相对肾重[SMD=-7.72,95%CI(-12.55,-2.88),I2=90%]、三酰甘油[SMD=-1.24,95%CI-1.94,-0.54),I2=0%]等指标.而大黄素与对照组在胆固醇[SMD=-1.19,95%CI(-2.29,-0.55),I2=77%]等方面的差异无统计学意义.同时Meta分析提示大黄素保护肾脏与nephrin的表达、相关信号通路等有关.此类研究相关的严重不良反应鲜有报道.结论:大黄素对糖尿病肾病动物肾脏有保护作用,但有待于更高质量、严谨规范的大样本临床试验进一步证实.

为利用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovarian,CHO)细胞表达系统制备重组猪干扰素-γ(recombinant porcine interferon gamma,rPoIFN-γ),并分析其体外抗病毒活性,本研究首先构建rPoIFN-γ真核表达质粒 pcDNA3.1-PoIFN-γ,转染悬浮培养的 CHO细胞,进行上清分泌表达,利用亲和层析纯化目的蛋白,并进行 SDS-PAGE 和 Western blotting 鉴定;通过 CCK-8 实验分析rPoIFN-γ对细胞的毒性,用VSV/PK-15 系统检测其抗病毒活性效价;最后分析rPoIFN-γ对塞内卡病毒A(Seneca virus A,SVA)的抗病毒活性及其对细胞内干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)和细胞因子的诱导作用.结果显示,本研究利用 CHO 悬浮细胞表达系统成功制备了纯化的rPoIFN-γ,该rPoIFN-γ对细胞无毒性,VSV/PK-15 系统检测其活性效价为 5.59×107 U/mg;此外,rPoIFN-γ 可诱导细胞内多种 ISGs 和细胞因子的表达,并显著抑制 SVA 的复制.总之,本研究成功利用 CHO表达系统制备了高活性的 rPoIFN-γ,并在体外完成其对 SVA的抗病毒作用分析,为rPoIFN-γ的功能及抗病毒制剂的研究提供了实验材料和基础.