目的:表达和纯化重组人Ⅲ型胶原蛋白（rhCol），并评价其性能。方法:构建重组基因工程菌pET30a（+）-1880/pACYCDuet-hy726/BL21（DE3），稳定共表达rhCol和脯氨酰羟化酶。通过大肠杆菌高密度发酵与盐析和柱层析蛋白纯化技术制备并纯化rhCol。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定rhCol的纯度，全自动蛋白质多肽测序仪测定rhCol的N端氨基酸序列，紫外分光光度法测定rhCol中的羟脯氨酸含量，噻唑蓝法评价rhCol的细胞相容性。结果:高密度发酵最终菌体湿重约200 g/L，表达量约3 g/L，通过亲和层析获得的rhCol的纯度大于95%。rhCol的羟脯氨酸含量为11.44%，其水溶性及细胞相容性良好。结论:本研究制备的rhCol可作为一种优良的生物材料广泛用于皮肤护理及生物医药等领域。

本研究旨在探究突散囊菌发酵液对肥胖大鼠脂质代谢和肠道菌群紊乱的影响,为其开发利用提供科学依据.SD大鼠被随机分为正常组、模型组和冠突散囊菌发酵液干预的低、中、高剂量组,以及血脂康阳性对照组.通过高脂喂养建立食源性肥胖大鼠模型,正常组和模型组给予无菌水灌胃,各剂量组灌胃不同剂量冠突散囊菌发酵液.实验为期8周,末次给药后收集粪便和血清,用于肠道菌群分析和相关生化指标测定,并摘取肝脏进行病理学观察.结果显示,模型组大鼠体质量和Lee's指数显著增加,血脂发生异常,肠道菌群多样性显著降低.冠突散囊菌发酵液显著降低了肥胖大鼠血清中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的含量,提高了高密度脂蛋白胆固醇的含量.测序结果亦显示,冠突散囊菌发酵液显著提高大鼠肠道菌群的多样性,上调瘤胃球菌NK4A214_group、UCG-005、Christensenellaceae_R-7_group 等菌群的丰度,下调拟杆菌属 Bacteroides 和 Turicibacter 的丰度.LefSe 分析还显示,冠突散囊菌发酵液可显著增加大鼠肠道中乳酸菌Lactobacillus丰度,提高肠道的防御功能.综上所述,冠突散囊菌发酵液能够有效改善高脂饮食肥胖大鼠的脂代谢及肠道菌群紊乱.

鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)不仅细胞膜含有比脂多糖更疏水的鞘糖脂,而且具有高效的代谢调控机制和基因调控能力,使其在威兰胶合成、环境修复和促进植物生长等方面具有巨大的应用潜力.目前国内在鞘氨醇单胞菌代谢机制方面的研究尚无新突破.本文主要综述了鞘氨醇单胞菌的系统分类、基因组学、基因调控机制及其应用等方面的研究,从基因层面分析鞘氨醇单胞菌产威兰胶的合成机制,为后续鞘氨醇单胞菌高密度发酵、工业化生产等研究提供理论基础,以便进一步发掘其在生物技术上的应用潜力.

[背景]肌醇是一种 B 族维生素,广泛应用于食品、医药、饲料等领域.微生物发酵法是最具前景的肌醇生产方法,但使用大肠杆菌生产的肌醇在食品及医药领域中的使用受到限制.毕赤酵母作为生物安全菌株是工业上生产异源蛋白的良好宿主,其本身含有天然的肌醇合成途径,具有被改造成为高效生产肌醇细胞工厂的潜力.[目的]通过代谢工程改造毕赤酵母工程菌株,降低副产物的生成并提高肌醇的产量.[方法]以实验室前期构建的产肌醇毕赤酵母工程菌株为出发菌株,确定副产物阿拉伯糖醇、核糖醇和甘露糖合成相关基因.通过关键基因敲除、发酵液中葡萄糖浓度控制降低副产物的产量.通过过表达甘油转运蛋白、甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶基因实现产肌醇毕赤酵母对甘油和葡萄糖的共利用,得到重组菌 Z10.经过发酵条件优化,进一步提高Z10 的肌醇产量.[结果]在最优条件下,重组菌Z10 的肌醇产量达到 36.7 g/L,是目前酵母类细胞工厂生产肌醇的最高值,副产物总产量与出发菌株相比降低了 63.1%.[结论]在毕赤酵母中建立了降低阿拉伯糖醇、核糖醇和甘露糖合成的有效策略,并通过甘油、葡萄糖共利用及相对应的发酵条件优化提高了肌醇产量,为肌醇及其他高价值生物活性物质在毕赤酵母中的高效生产提供了重要参考.

研究以地衣芽孢杆菌FA6活菌数为指标,采用单因素实验和响应面法实验优化了地衣芽孢杆菌FA6发酵培养基和发酵条件,获得了地衣芽孢杆菌FA6最佳发酵培养基:70 g/L可溶性淀粉、40 g/L酪蛋白胨、2 g/L K2HPO4、1g/LKH2PO4、2 g/L Na2HPO4、2 g/L MgSO4和8 g/L NaCl;以及最佳发酵条件:初始pH 7.0、接种量1％、发酵温度28.8℃、发酵时间31h、装液量50 mL/250 mL和转速160 r/min.在此发酵培养基和发酵条件下,地衣芽孢杆菌FA6活菌数为7.97×109 CFU/mL,较优化前提高了8.1倍.最佳发酵工艺的获得,将能够为鱼源芽孢杆菌的高密度生产,产业化应用提供基础.

大肠杆菌因为生长速度快,易于培养,代谢可塑性强,拥有丰富的遗传和基因工程工具,成为代谢工程和合成生物学的最佳宿主之一[1].利用重组大肠杆菌的高密度发酵,可以获得较高的生物量和显著提高目的基因表达产物的浓度[2].但在工业发酵过程中,影响生物量产出的因素非常多,比如培养基的成分(细菌生长所需的营养物质)、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧浓度、培养温度、发酵液的 pH值、补料方式以及发酵液流变学特性等[3].近几年国内有关大肠杆菌高密度培养的文献报道表明,发酵32 h 内的菌体密度大概在 OD600 为 79 ～ 125[4-6].

本研究旨在以毕赤酵母为底盘细胞构建赤藓糖醇生产菌株.通过调控糖酵解途径中磷酸果糖激酶基因pfk的表达,敲除副产物阿拉伯糖醇和核糖醇生产相关基因,过表达不同来源的 4-磷酸赤藓糖磷酸化酶、赤藓糖还原酶和糖醇磷酸酶,构建毕赤酵母赤藓糖醇生产菌株,对过表达戊糖磷酸途径关键酶转酮酶(TKL)、磷酸核酮糖差向异构酶(RPE)及赤藓糖还原酶对赤藓糖醇产量的影响也进行了探究.结果表明,过表达酿酒酵母来源的糖醇磷酸酶基因pyp1 及大肠杆菌来源的4-磷酸赤藓糖磷酸化酶基因yidA的工程菌株C8 具有赤藓糖醇生产能力,摇瓶发酵产量为 30 mg/L;进一步过表达tkl和rpe后,菌株C10 摇瓶发酵产量提高约 40 倍,达到 1.2 g/L,高密度发酵产量为 10.6 g/L;赤藓糖还原酶的过量表达并没有提升赤藓糖醇的产量,反而提高了副产物的产量.本研究首次在毕赤酵母中成功构建了赤藓糖醇合成通路,为改造毕赤酵母高效生产赤藓糖醇及其他高价值化合物奠定基础.

目的 比较10株乳酸菌的活菌数,筛选高密度共生发酵和高黏附性的共培养菌株,为后期开发应用奠定基础.方法 对单个菌株及共培养菌株进行发酵活菌数的筛选,筛选出对Caco-2细胞黏附性强的优势菌株,并比较其耐酸、耐胆盐和抑制肠道致病菌能力.结果 10株益生菌菌株中,鼠李糖乳酪杆菌AI-11与发酵粘液乳杆菌AI-25、两歧双歧杆菌AI-91与动物双歧杆菌乳亚种AI-01的组合菌株较单个菌株具有协同效应,活菌数显著高于单个菌株(均t=8.878 0,P＜0.001),且具有较好的抑制肠道致病菌大肠埃希菌和奇异变形杆菌的效果,较好的耐受pH2.5的酸性环境和胆汁盐环境的特性,较鼠李糖乳酪杆菌GG和发酵粘液乳杆菌CECT 5716具有较好的Caco-2细胞黏附性(t=9.004 1,P＜0.001;t=11.301 2,P＜0.001).结论 筛选出的2个共培养组合菌株在发酵能力和细胞黏附性方面具有活菌数高、黏附性强的优势,可应用于食品、功能食品及膳食补充剂中,以增强改善肠道菌群的功效性.

目的 采用汉逊酵母系统重组表达GⅡ.4型诺如病毒(norovirus,NoV)主要结构蛋白VP1,对纯化后获得的两种不同形态类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs)分别进行理化性质鉴定和免疫效果评价.方法 将表达GⅡ.4型VP1蛋白的重组工程菌高密度发酵,纯化后获得两种不同形态的VLPs;通过Western blot、SEC-HPLC、动态光散射法和透射电镜等方法检测两种VLPs的理化性质.将两种VLPs分别免疫BALB/c小鼠,比较免疫血清对两种颗粒的抗体结合性和组织血清抗原(histo-blood group antigen,HBGA)-VLPs阻断水平.结果 纯化后可获得两种不同直径的VLPs,颗粒均一度良好;动态光散射测定两种颗粒水合粒径分别为53.98 nm和45.18 nm.两种VLPs与HBGA受体结合类型和程度相似,大颗粒VLPs的免疫血清对两种颗粒的结合性和HBGA-VLPs阻断抗体水平均高于小颗粒VLPs,但差异无统计学意义(P>0.05).结论 汉逊酵母表达NoV GⅡ.4 VP1蛋白,可形成形态不同的两种重组VLPs,两种VLPs具有相似的理化性质和免疫原性,但大粒径VLPs可能更适合作为重组人诺如病毒疫苗的抗原组分.

目的:观察诺丽果汁和纳豆两种发酵食品对实验性糖尿病小鼠血糖及血脂的影响.方法:ICR雌性小鼠一次性尾静脉注射四氧嘧啶(55 mg/kg),72 h后将空腹血糖值≥12.00 mmol/L、尿糖呈强阳性(+++)者视为糖尿病小鼠模型将糖尿病模型小鼠随机分为3组(n=10):模型(DM)组、诺丽果汁(NJ)组和纳豆(NT)组,另取10只正常ICR雌性小鼠作为正常对照(NC)组.NJ组、NT组分别给予诺丽果汁(25.0 ml/kg)、纳豆(0.6 g/kg)灌胃,其他两组小鼠分别给予生理盐水(25.0 ml/kg)灌胃,连续给药30 d,小鼠自由进食、饮水,记录小鼠饮水量及进食量. 末次给药后1.5h,测定小鼠葡萄糖耐量,经股动脉采血测定小鼠糖化血清蛋白(GSP)、血清胰岛素(Ins)和血脂等指标的变化情况.结果:与NC组比较,DM组小鼠饮水量、进食量、GSP及血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)等均显著升高(P＜0.01),葡萄糖耐量、Ins及高密度脂蛋白(HDL)均显著降低(P＜0.01);与DM组比较,NJ组与NT组小鼠GSP、TG及LDL均明显降低(P＜0.01,P＜0.05),葡萄糖耐量、Ins和HDL明显升高(P＜0.05).结论:诺丽果汁与纳豆具有降低糖尿病模型小鼠血糖、增加糖耐量及改善血脂的作用,提示二者对糖尿病防治可能具有一定的应用价值.