外泌体(exos)作为一种直径在40～150 nm之间的细胞外囊泡，在介导细胞间通讯中扮演着重要角色。新的证据表明，肿瘤细胞分泌的exos(TEXs)可通过传递微小RNAs对肿瘤微环境中的免疫细胞进行驯化，使其处于免疫抑制状态，从而为肿瘤的生长、进展和转移提供有利支持。本综述旨在对TEXs微小RNAs在介导肿瘤免疫抑制中的研究进展进行总结，从而为深入理解肿瘤微环境中TEXs介导的肿瘤细胞和免疫细胞的"crosstalk"提供参考。

目的 通过无血清悬浮驯化CHO-K1细胞,筛选出单克隆源性可追溯、生长状态良好的宿主细胞株,并进行表达验证.方法 采用逐步降低血清含量的方法,将贴壁状态的CHO-K1细胞驯化成适应无血清培养基培养的悬浮细胞;通过单细胞接种/成像系统Verified In-Situ Plate Seeding(简称VIPS系统)筛选单克隆,经连续培养综合评估单克隆细胞的倍增时间、结团率、细胞直径等参数,确定候选克隆;将候选克隆分别转染携带绿色及红色荧光蛋白的质粒,根据荧光蛋白表达情况确定1株克隆作为工程细胞株的宿主细胞.结果 驯化获得的CHO-K1细胞适应无血清悬浮培养,倍增时间为20～24 h;通过单克隆筛选和产量评估确定的单克隆细胞株单克隆源性良好且可追溯,以0.5 × 106个/mL的细胞密度接种,培养7 d最高细胞密度可达8.27 × 106个/mL,活率不低于80％,平均倍增时间20.31h,能较好地表达外源基因.结论 通过无血清驯化培养,成功获得单克隆源性可追溯、生长状态良好且能够用于蛋白高表达的CHO-K1细胞株.

目的 将贴壁培养的MDCK细胞驯化为悬浮培养,建立悬浮细胞系,并进行检定,以期为细胞基质流感疫苗的研发奠定基础.方法 采用摇床适应法将贴壁培养的MDCK(NBL-2)细胞驯化为悬浮培养细胞,命名为MDCK-S细胞,进行18S及物种特异性PCR鉴定.将MDCK-S细胞传代至33代,作为主代细胞库(master cell bank,MCB);传代至38代,作为工作细胞库(working cell bank,WCB).MCB及WCB细胞均进行生物学特征、污染情况、透射电镜、成瘤性和致瘤性、染色体变异性及流感病毒敏感性检测.结果 确认MDCK-S细胞为狗源细胞,且未发现突变、缺失等情况,无其他种属DNA污染.MCB及WCB细胞生长状态良好,生长曲线呈"S"型,倍增时间分别为27.78及27.21h;细菌、真菌及支原体检查均为阴性;细胞形态、结构及细胞膜完整,膜上微绒毛较多,表明细胞状态好,不同细胞代次之间差异较小;具有成瘤性,但不具有致瘤性;染色体2 n=(78±2)条占比为86％～96.19％,P29～P50代细胞染色体数目保持稳定;对流感病毒较敏感.结论 成功将MDCK细胞驯化为悬浮培养,并建立了悬浮细胞系MDCK-S.本研究为细胞基质流感疫苗的研发奠定了基础.

乌兰布和沙漠东北段的防护林是保护东部河套平原农业生产的重要生态屏障,由于对人工造林研究缺乏重视,许多防护林体系中的林分有一定的衰退趋势.研究乡土树种人工栽培后的生态适应性,是指导人工防护林建设和可持续经营的重要举措.为了深入探究乌兰布和沙漠乡土树种人工栽培后的生态适应性,本文以 3种乡 土树种沙冬青(Ammopiptathus mongolicus)、霸王(Zygophyllum xanthoxylon)和蒙古扁桃(Prunus mongoli-ca)为研究对象,通过测定功能性叶片表皮形态、解剖结构、生理指标,结合当地气象数据,阐释3种植物对沙漠环境的适应机制.结果表明:3种植物分别以不同方式适应沙漠环境.沙冬青通过增大叶面积来增加受光面积、提高光合效率,利用密集的表皮毛和发达的角质层强化叶片机械防御能力,降低强光灼伤及水分蒸腾,维持细胞水分平衡,从而降低细胞膜脂过氧化.蒙古扁桃叶片簇生,通过增加叶片数量增加受光面积、提高光合效率,通过卷曲叶片躲避强光灼伤,通过特化气孔位置(将气孔全部分布于叶片下表面),利用发达的维管束、丰富的黏液细胞和晶体结构来降低水分蒸腾,维持细胞水分平衡,从而降低细胞膜脂过氧化.霸王叶片呈圆柱状条形结构,通过降低风阻,降低叶片遭受风沙流危害的概率,通过生理代谢调节提高叶片抗氧化物酶活性和渗透调节物质含量,维持细胞水分和活性氧代谢平衡.这些发现揭示了 3种植物在应对荒漠环境时所采取的不同的适应策略,为乌兰布和沙漠东北部乡土树种的引种驯化提供了新思路.

目的 将贴壁培养的Vero细胞驯化成悬浮培养细胞,并对其生物学特性进行研究.方法 采用无血清培养和"摇床适应法"对细胞进行培养优化,对其进行成瘤性、短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析、透射电子显微镜形态,以及对流感病毒敏感性检测.结果 成功建立悬浮细胞系Vero-S,Vero-S细胞生长期在 24～72 h,平台期在 108～144 h之间,衰退期在 144 h以后,细胞 PDT为 36 h,细胞密度在14.01～14.88×108 个/L之间,细胞平均圆度在 0.73～0.75 之间,细胞直径在 12.12～14.44 μm之间.Vero-S细胞在裸鼠皮下形成肿瘤,而悬浮培养前的Vero细胞不具有成瘤性;STR显示为猴源细胞系;电镜下细胞结构完整;Vero-S细胞对流感病毒感染不敏感.结论 悬浮细胞系Vero-S细胞的生长经历与贴壁细胞类似的生长期、平台期、衰退期,且细胞大小均一,建立的悬浮培养基能够支持Vero-S细胞高密度生长.STR结果表明悬浮Vero细胞具有完全的遗传稳定性,透射电镜下与贴壁Vero细胞无明显区别.为细胞悬浮驯化培养技术提供参考价值,并可用于细胞致肿瘤的机理研究.

目的 探究去泛素化酶在单核细胞驯化免疫中的作用及机制.方法 Q-PCR检测单核细胞驯化免疫中去泛素化酶相关基因的表达情况;ELISA法检测去泛素化酶对驯化的单核细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的影响;双荧光素酶报告基因检测系统测定去泛素化酶对NF-κB信号通路的影响.双荧光素酶报告基因检测系统测定:UCHL1对NF-κB 信号通路的影响、UCHL1与NF-κB信号通路关键信号分子之间的作用及UCHL1影响NF-κB信号通路所依赖的酶活性;ELISA法检测UCHL1对单核细胞驯化作用中TNF-α分泌水平的影响.结果 去泛素化酶USP2、UCHL1、OTUB2和OTUD4在单核细胞驯化免疫中的表达量明显升高;去泛素化酶抑制剂可明显抑制驯化单核细胞中TNF-α的分泌水平;USP2、UCHL1、OTUB2、PSMD14 等可明显激活 NF-κB 信号通路,通过上述实验筛选出对NF-κB影响最为明显的UCHL1进行后续研究.UCHL1的表达明显影响NF-κB信号通路的激活;UCHL1的表达促进了由IκB-α、IKK-α或IKK-β介导的NF-κB的激活;UCHL1主要通过其泛素水解酶活性调控NF-κB信号通路;UCHL1抑制剂可明显减弱单核细胞的驯化作用.结论 自身免疫病中免疫复合物可以驯化单核细胞增强其敏感性,这种作用可通过UCHL1调节NF-κB信号通路的激活实现.

流感是一种常见的呼吸道疾病,由流感病毒引起,接种疫苗是预防流感的有效手段.MDCK细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells)具有易于培养和高产量的特点,可以支持流感病毒的复制和增殖,被广泛用于流感疫苗的研究和生产.随着对流感病毒研究的不断深入,为了进一步拓展MDCK细胞用于流感病毒研究和工业应用的能力,研究人员开始发展MDCK细胞无血清全悬浮培养技术.通过长期的培养和优化,驯化的MDCK悬浮细胞株可以更好地适应流感病毒的生长环境,提高流感病毒的产量和感染性.总之,MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感病毒研究和工业应用中发挥着重要作用,为流感疫苗生产和抗流感药物研发提供更好的工具.同时也必须重视MDCK细胞的安全性,采取合适的措施来确保其应用的安全性和可靠性.

蓝细菌是唯一可进行放氧光合作用的原核微生物,基于光合蓝细菌构建"自养型细胞工厂"具有广阔前景.但以蓝细菌作为底盘进行生物燃料及化学品的合成仍存在细胞耐受能力差、产量低等问题,导致实现工业化生产的经济可行性还比较低,亟需通过合成生物学等技术手段构建新的藻株.近年来,实验室适应性进化(adaptive laboratory evolution,ALE)已被用于底盘工程中,实现了优化生长速度、增加耐受性、加强底物利用和提高产品产量等目标.ALE 在提高蓝细菌鲁棒性方面取得了一定进展,已获得了耐受高光、重金属离子、高盐和高浓度有机溶剂胁迫的进化藻株.但是,蓝细菌中的 ALE 策略效率相对较低,耐受各胁迫的分子机制并未阐释完全.本文综述了ALE 相关技术策略及其在蓝细菌底盘工程中的应用,讨论了如何借鉴其他微生物中 ALE 手段,构建更大 ALE 突变文库、增加菌株的突变频率、缩短进化时间、探索多重胁迫耐受工程菌构建原则及研究策略等,高效解析进化菌株的突变体库,构建高产量、鲁棒性强的工程菌株等,以期未来促进蓝细菌底盘的改造及其工程菌的规模化应用.

目的 了解Ⅱ型登革病毒感染对白纹伊蚊生存的影响,为登革热防控提供基础资料.方法 通过培养白纹伊蚊C6/36细胞,对Ⅱ型登革病毒进行扩增并收获.实验室驯化的白纹伊蚊羽化后,每天用现配的10％葡萄糖水喂养,于温度28℃,湿度≥70％条件下饲养,至3～5日龄时用于感染实验,感染前一天挑出雄蚊,将雌蚊分为感染组和未感染组,并断食断水.感染时分别吸食含与不含Ⅱ型登革病毒的血餐(未感染组血餐除不含Ⅱ型登革病毒外,其余成分与感染组血餐相同),挑取饱血蚊采用10％葡萄糖水维持饲养,每天观察、记录两组白纹伊蚊的生存情况.吸食血餐后第14天时,采用荧光定量PCR法检测感染组白纹伊蚊Ⅱ型登革病毒核酸,计算病毒感染率.计算并比较感染组与未感染组白纹伊蚊的生存率,用生存分析方法,绘制两组白纹伊蚊的生存曲线并进行log-rank检验.结果 感染组共饲养99只感染实验后的饱血白纹伊蚊,未感染组共饲养83只未经感染实验饱血白纹伊蚊,感染实验后第14天,感染组和未感染组白纹伊蚊分别死亡31只和15只,死亡率分别为31.31％(31/99)和18.07％(15/83),感染组死亡率高于未感染组.经log-rank检验,感染组白纹伊蚊生存曲线低于未感染组(x2=4.121 9,P＜0.05).荧光定量PCR检测感染组白纹伊蚊的感染率为77.94％(53/68).结论 Ⅱ型登革病毒感染白纹伊蚊可降低白蚊伊蚊生存率.

在IL-5靶点药物的发现阶段,为评价候选药物的阻断活性,需建立依赖IL-5增殖且信噪比高、重现性好的检测用细胞株.TF-1是人白血病细胞,其生长完全依赖IL-3或GM-CSF,而IL-5与IL-3和GM-CSF共用β(βc)受体,因此,研究以GM-CSF依赖的TF-1细胞株为来源,用IL-5替换TF-1细胞生长必需的生长因子GM-CSF,降低血清含量进行细胞驯化培养传代.通过35 d的细胞驯化及3～5次降血清传代培养,采用有限稀释法分离单克隆,一共得到14个单克隆细胞株.对14株细胞进行FACS检测,其中,有9个细胞株IL-5Rα表达量升高.对IL-5Rα过表达的细胞株进行IL-5增殖检测,结果表明,相比8％FBS得到的单克隆,6％FBS得到的单克隆对IL-5刺激更敏感.通过单因素优化实验,细胞增殖检测最优的细胞接种量为2×104个/孔,FBS含量为3％,血清品牌为Gibco.驯化后的细胞TF-1-9E3对IL-5的剂量-效应曲线的信噪比为3.19,Emax区间为2.15,可用于IL-5的生物学活性检测及IL-5与IL-5Rα的抗体阻断活性检测.