本研究旨在解析东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的腺苷酸激酶(Adenylat kinase,ADK)NcADK的理化性质和分子特性,并检测NcADK基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程中的表达特征,以期丰富NcADK相关信息,并为进一步的功能研究提供依据.利用相关生物信息学软件预测和分析NcADK的理化性质、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构.使用MEME软件和Batch CD-Search工具分别预测东方蜜蜂微孢子虫和其它7种微孢子ADK蛋白的保守基序和保守结构域.通过Mega 11.0软件基于ADK氨基酸序列构建进化树.采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中NcADK的相对表达量.结果表明,NcADK的CDS含有540个核苷酸,可编码179个氨基酸;NcADK的分子量约为20.66 kDa,分子式为C903H1488N258O278S8,脂肪系数为100.61,平均亲水系数为-0.502,等电点为6.83,含29个负电荷氨基酸和29个正电荷氨基酸;NcADK可同时定位于细胞质、线粒体、细胞核、囊泡和过氧化物酶体;NcADK含20个磷酸化位点,不含典型的信号肽;NcADK含88个a-螺旋,24条延长链,17个β-转角,50个无规则卷曲,与模板A0A0F9WEU7.1.A之间的序列同源性为100％;在东方蜜蜂微孢子虫、东方赤孢子虫Hamiltosporidium tvaerminnensis、肠脑炎微孢子虫Encephalitozoon intestinalis、按蚊微孢子虫 Anncaliia algerae 和角膜条孢虫 Vittaforma corneae ADK 中均鉴定到 1 个相同的结构域和5个相同的保守基序;东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫Nosema apis的ADK在进化树上聚为一支.相较于接种后1 d(1 day post inoculation,1 dpi),NcADK的表达量在2 dpi上调但无显著差异(P＞0.05),在3 dpi和4 dpi均显著上调(P＞0.05).研究结果明确了NcADK的理化性质和分子特性,并揭示NcADK是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白,不同微孢子虫的ADK具有较强的保守性,东方蜜蜂微孢子虫及其姐妹种蜜蜂微孢子虫的ADK具有高同源性,NcADK在3 dpi和4 dpi被激活表达.

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)是真核生物中分布广泛、含量丰富且作用关键的一类RNA修饰.东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae专性侵染成年蜜蜂导致微孢子病,给养蜂业造成很大损失.本研究对东方蜜蜂微孢子虫的甲基转移酶样蛋白 5(Methyltransferase-like protein 5,Mettl5)基因 NcMettl5 进行克隆,通过生物信息学预测 NcMettl5 蛋白的理化性质和分子特性,并通过RT-qPCR检测NcMettl5在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程的相对表达量,以期丰富NcMettl5的信息,并为探究东方蜜蜂微孢子侵染中NcMettl5的功能及调控机制提供基础.结果表明,扩增出约 600 bp的目的片段,与GenBank数据库收录的预测出的NcMettl5序列一致;NcMettl5 的分子量约为 22.64 kDa,分子式为 C1039H1645N269O284S6,理论等电点是9.37,脂溶系数是98.98,不稳定系数为13.96;包含196个氨基酸和20个磷酸化位点;平均亲水系数为-0.230,不含典型的跨膜结构域和信号肽,可同时定位于细胞骨架、细胞质和细胞核、细胞核、线粒体和过氧化物酶体;NcMettl5 含有 1 个超家族结构域:AdoMet_MTases superfamily;东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫Nosema bombycis CQ1 和颗粒病微孢子虫Nosema granulosis的Mettl5均含有 7 个相同的保守基序,序列一致性较高,且进化距离较近;NcMettl5 在东方蜜蜂微孢子虫接种后 1-4 d的意大利蜜蜂工蜂中肠内均有表达;相较于接种后 1 d(1 day post inoculation,1 dpi),NcMettl5 的表达量在 2 dpi和 3 dpi下调但差异不显著(P＞0.05),在 4 dpi显著下调(P＜0.05).研究结果表明成功克隆到东方蜜蜂微孢子虫的 NcMettl5 基因,明确了 NcMettl5 蛋白的分子特性,并揭示NcMettl5 可能为亲水性蛋白、非跨膜蛋白和胞内蛋白,Nosema 属的东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫和颗粒病微孢子虫的Mettl5 蛋白具有较高的保守性,NcMettl5 在东方蜜蜂微孢子虫增殖周期内真实表达且总体呈持续下降的表达趋势.

[目的]东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae作为蜜蜂微孢子虫病的主要病原体,对其侵染机制的相关研究鲜有报道.本研究旨在对团队前期通过质谱鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER_100148进行原核表达,明确其亚细胞定位,并初步探索其生物学功能.[方法]通过在线软件对前期鉴定的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER_100148序列进行生物信息学分析;利用RT-PCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染后西方蜜蜂Apismellifera成蜂中肠中NcER_100148的表达量;将NcER_100148基因片段克隆至原核表达载体pET30a中,IPTG诱导表达重组蛋白并用于制备多克隆抗体;利用Western blot检测NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中的表达量;通过间接免疫荧光和免疫电镜技术分析NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中的亚细胞定位;利用Western blot和免疫共沉淀法分别分析重组蛋白NcER_100148与东方蜜蜂微孢子虫几丁质孢子壳(chitin spore coats,CSCs)和极管蛋白NcPTP2和NcPTP3的相互作用关系.[结果]序列分析结果表明,东方蜜蜂微孢子虫NcER_100148预测分子量为12.169 kD,含1个0-糖基化位点、1个N-糖基化位点和1个糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定位点;RT-PCR检测结果表明,NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫感染后4 d时的西方蜜蜂成蜂中肠中开始表达;Western blot结果表明,NcER100148蛋白能在成熟孢子表面表达,并且能够与东方蜜蜂微孢子虫的CSCs互作;亚细胞定位结果显示NcER_100148定位于东方蜜蜂微孢子虫的成熟孢子孢壁上;Western blot和免疫共沉淀结果显示重组蛋白NcER_100148能够与极管蛋白NcPTP2和NcPTP3相互作用.[结论]NcER_100148是定位在东方蜜蜂微孢子虫的成熟孢子孢壁上的一个新型孢壁蛋白,且其可能在孢子内壁的构建、极管的盘绕与固定和参与对宿主的侵染等过程中扮演重要的角色.

东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae是专性寄生蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌,对意大利蜜蜂(意蜂)具有较强的侵染性.本研究利用RNA-seq技术对正常10 d(Apis mellifera ligustica control group,AmCK)和N.ceranae胁迫10 d的意蜂工蜂中肠(Apis mellifera ligustica treatment group,AmT)进行测序,共得到160 847 237 100条原始读段,过滤后得到1 066 955 298条有效读段.主成分分析结果显示AmCK与AmT测序样品的组内重复性较好,组间的基因表达模式差异明显.GO分类结果显示,AmCK与AmT的前100位高表达基因(HEGs)分别分布于32和33个GO terms,基因富集数最多的均为代谢进程.KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果显示,AmCK的前100位HEGs富集在21个pathways,基因富集数最多的是内吞作用、信号通路和嘌呤代谢;AmT的前100位HEGs富集在26个pathways,基因富集数最多的是内吞作用、RNA转运和蛋白质的内质网加工.前100位HEGs的Venn分析结果显示AmCK与AmT的共有HEGs为87个,特有HEGs分别均为13个.研究结果揭示了Ⅳ.ceranae胁迫意蜂工蜂中肠过程中的基因表达谱信息,也为解析Ⅳ.ceranae致病的分子机理提供了有益信息和线索.

东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae是一种寄生于蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌,对蜜蜂的健康危害严重,给世界各国的养蜂业造成较大损失.本研究基于前期获得的N.ceranae孢子的转录组数据对其已注释基因进行结构优化,并对未注释基因进行预测和分析.通过将测序得到的clean reads比对参考基因组和转录本重构,共对10个N.ceranae的已注释基因的5'端或3'端进行了延长.利用Cuffcompare软件将重构转录本与参考基因组进行比对,共鉴定出27个新基因,随机挑选9个新基因进行RT-PCR验证,均能扩增出符合预期的目的片段,表明预测出的新基因真实存在.有6个新基因能够注释到GO数据库和6个基因注释到KEGG数据库.进一步分析结果显示上述新基因注释到细胞等10个GO条目上,它们可能在N.ceranae的生命活动中具有重要功能.研究结果为N.ceranae的基因结构和功能注释信息的完善提供了有益补充,也为新基因的功能研究打下了基础.

[目的]以西方蜜蜂Apis mellifera工蜂肠道为例探究组织透明化技术——丙烯酰胺交联替换脂质透明硬化成像/免疫染色/原位杂交兼容组织水凝胶(clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatible tissue-hYdrogel,CLARITY)在昆虫组织上的应用,确定CLARITY与荧光原位杂交(FISH)相结合在昆虫肠道组织透明化中的适用性.[方法]依照CLARITY技术操作程序,用水凝胶固定西方蜜蜂肠道,并以被动方式透明化,再用靶向东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae 16S rRNA带异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记和靶向真核细胞18S rRNA带Texas RED标记的寡核苷酸荧光探针进行肠道组织的荧光原位杂交,然后用DAPI(蓝色)进行细胞核复染,通过激光共聚焦显微镜观察透明化的染色组织.[结果]首次成功将西方蜜蜂肠道组织透明化.在激光共聚焦显微镜下,观察到马氏管的原始分布形态,以及东方蜜蜂微孢子虫在中肠末端分布更密集的空间分布特征,并实现了对肠道组织的3D重构.[结论]CLARITY能应用于蜜蜂肠道组织透明化,透明化组织能进行原位杂交和激光共聚焦观察.CLARITY和FISH相结合免除抗体制备和石蜡切片的麻烦,直观展示肠道内部的真实状态,为昆虫生理病理研究提供了一种可靠特异的标记方法.

[目的]本研究旨在通过差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)分析以及毒力因子和其他侵染相关因子分析,在转录组水平揭示东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的分子机制.[方法]基于前期已获得高质量的东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子(NcCK)及侵染意大利蜜蜂工蜂7和10 d的东方蜜蜂微孢子虫(分别为NcT1和NcT2)转录组数据,根据P≤0.05且|log2(Fold change)|≥1的标准,通过比较分析筛选出NcCK vs NcT1,NcCK vsNcT2和NcT1 vs NcT2比较组的DEG.通过相关生物信息学软件对上述DEG进行Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析.根据Nr和KEGG数据库注释信息和相关文献进行对东方蜜蜂微孢子虫的毒力因子和侵染相关因子的统计和分析.通过RT-qPCR验证转录组数据及DEG表达趋势.[结果]从NcCK vs NcT1,NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组分别鉴定出1 397,1 497和52个DEG.Venn分析结果显示各比较组共有的上调和下调基因分别为10和1个.GO分类结果显示,NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中DEG富集数最多的功能条目为代谢进程、细胞进程、单组织进程、细胞、细胞组件、细胞器、催化活性和结合,而NcT1 vs NcT2中DEG富集数最多的是代谢进程、细胞进程、单组织进程、催化活性和结合.KEGG代谢通路富集分析结果显示,NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中DEG分别富集到80和79条通路;富集在糖酵解/糖异生和MAPK信号通路的上调基因数量多于下调基因.毒力因子分析结果显示,孢壁蛋白9基因和孢壁蛋白12基因在NcCKvs NcT1和NcCK vs NcT2中均下调表达,孢壁蛋白8基因仅在NcCK vs NcT1中表达量下调;此外孢壁蛋白前体基因、孢壁和锚定盘复合蛋白基因、几丁质合酶基因、极管蛋白基因、蓖麻毒素B凝集素基因的表达水平在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中表现为上调.侵染相关因子分析结果表明,糖酵解途径的3个关键酶基因在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中上调表达;3个涉及ATP/ADP移位酶的基因在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中上调表达,但有1个表达量下调;2个涉及ABC转运蛋白的基因在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2中上调表达,另有4个下调表达.RT-qPCR结果证实了本研究中转录组数据及DEG表达趋势的真实可靠性.[结论]本研究通过比较分析解析东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程的转录组动态,揭示了孢壁蛋白、孢壁和锚定盘复合蛋白、几丁质酶、极管蛋白和蓖麻毒素B凝集素等毒力因子编码基因,以及己糖激酶、丙酮酸激酶、6-磷酸果糖激酶、ATP/ADP移位酶和ABC转运蛋白等侵染相关因子编码基因在病原增殖中扮演重要角色,为阐明东方蜜蜂微孢子虫的侵染机制提供了基础.

[目的]通过深度测序和组学分析在small RNA组学层面揭示意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的免疫应答机制.[方法]利用small RNA-seq技术对正常及N.ceranae胁迫7d和10d的意蜂工蜂中肠(Am7CK、Am7T、Am10CK和Am10T)进行深度测序.利用相关生物信息学软件对测序数据进行质控、已知microRNA (miRNA)鉴定、新miRNA预测及miRNA的结构特征分析.通过Stem-loop RT-PCR验证新miRNA的表达.按照|log2(Fold change)≥1和P≤0.05的标准筛选出Am7CK vs.Am7T和Am10CK vs.Am10T比较组的差异表达miRNA (differentially expressed miRNA,DEmiRNA).利用软件预测DEmiRNA靶向结合的mRNA并进行GO和KEGG数据库注释,根据注释信息对细胞和体液免疫相关通路及富集靶mRNA进行统计和分析.根据靶向结合关系构建DEmiRNA和免疫通路相关差异表达mRNA (differentially expressed mRNA,DEmRNA)的调控网络.采用RT-qPCR对数据的可靠性和DEmiRNA的差异表达进行验证.[结果]共获得165895574条原始读段和132028990条有效序列标签,各组的组内Pearson相关性平均在87.92％及以上.共鉴定到928个已知miRNA和56个新miRNA.这些miRNA的长度介于18-28 nt,多数的长度为18 nt和22 nt且首位碱基主要偏向U.验证了12个新miRNA的真实表达.Am7CK vs.Am7T比较组包含48个上调miRNA和36个下调miRNA;Am10CK vs.Am10T比较组包含56个上调miRNA和51个下调miRNA.两个比较组的DEmiRNA可分别靶向结合9827个和10720个mRNA.这些靶mRNA可分别注释到50和47条功能条目,以及138和135条KEGG通路.DEmiRNA与免疫通路相关靶mRNA的调控网络分析结果显示,Am7CK vs.Am7T中有26个DEmiRNA靶向与内吞作用等免疫通路相关的10个DEmRNA;Am10CK vs.Am10T中有15个DEmiRNA靶向与MAPK信号通路等免疫通路相关的10个DEmRNA.验证了测序数据和4个DEmiRNA差异表达的可靠性.[结论]研究结果揭示了宿主DEmiRNA可能通过调控物质和能量代谢、细胞和体液免疫对N.ceranae产生应答,但DEmiRNA不参与抗菌肽基因的表达调控;miR-1-z可能参与宿主的细胞增殖、细胞凋亡和免疫进程;氧化磷酸化通路可能在宿主免疫应答及宿主-病原互作中发挥特殊作用.

本研究旨在基于已获得的第三代纳米孔全长转录组数据对东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae基因的可变剪接(alternative splicing,AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)进行分析.通过Astalavista软件鉴定东方蜜蜂微孢子虫基因的AS事件类型.采用TAPIS pipeline对东方蜜蜂微孢子虫基因的APA位点进行鉴定.利用MEME软件分析所有全长转录本的poly(A)剪接位点上游50bp的序列特征并鉴定motif.共鉴定出发生于5个基因的5次AS事件,包括1次可变供体位点(alternative donor site,ADS)和4次内含子保留(intron retention,IR).鉴定出233个基因发生APA,其中含有1个poly(A)剪接位点的基因数量最多(143,61.37％).序列特征分析结果显示,东方蜜蜂微孢子虫全长转录本的3'UTR的上下游表现出明显的碱基倾向性,U在3'UTR的上游富集,而A在3'UTR的下游富集.此外,在东方蜜蜂微孢子虫全长转录本的poly(A)剪接位点上游鉴定到3个motif(AAUAAA、UGAUGC和GCGACG).研究结果揭示了东方蜜蜂微孢子虫转录组的复杂性,完善了现有的参考基因组和转录组注释,也为深入探究不同剪接异构体的分子功能提供了基础.此外,本研究为其他真菌的AS和APA研究提供了有益的思路和方法借鉴.

[目的]本研究旨在利用Oxford Nanopore测序技术组装和注释东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的高质量全长转录组.[方法]采用Nanopore PromethION系统对东方蜜蜂微孢子虫的纯净孢子进行转录组测序.通过识别每条clean read两端引物鉴定全长转录本序列.利用Blast工具将全长转录本比对Nr,Swiss-Prot,KOG,eggNOG,Pfam,GO和KEGG数据库,获得相应注释信息.分别利用蛋白结构域分析方法CPC,CNCI,CPAT和Pfam对长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)进行预测,获得高可信度lncRNA.利用CPM(counts per million)法计算每一条全长转录本的表达量.[结果]利用Nanopore PromethION系统对东方蜜蜂微孢子虫转录组测序共测得6 988 795条raw reads,经质控获得6 953 469条clean reads,其中包含5 143 999条全长转录本.共鉴定到10 243条非冗余全长转录本,N50和平均读长分别为1 042 bp和894 bp,最大读长为4 855 bp.有9 342,4 038,4 283,2 569,4 859和3 450条全长转录本分别注释到Nr,KOG,eggNOG,Pfam,GO和KEGG数据库.注释到东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫Nosema apis和家蚕微孢子虫Nosema bombycis的全长转录本数量最多.共鉴定到87条高可信度lncRNA,包含49条正义链lncRNA(sense lncRNA)、25条反义链lncRNA(anti-sense lncRNA)和13条基因间区lncRNA.本研究的测序量足以检测到全部表达的全长转录本,全长转录本的表达量(CPM)范围在0.1到10 000以上.[结论]本研究构建和注释了东方蜜蜂微孢子虫的高质量全长转录组数据,可为病原的比较转录组分析、转录本的可变剪接和可变腺苷酸化分析、简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)位点挖掘、基因结构优化以及基因全长序列克隆及功能研究提供关键基础.