目的 利用昆虫细胞表达体系制备人乳头瘤病毒(HPV)31 L1病毒样颗粒(VLP)疫苗.方法 化学合成法获得昆虫Sf9细胞偏性密码子优化的、C端删除27个氨基酸编码序列的HPV31 L1截短基因( HPV31 L1MΔC),构建重组杆状病毒,感染Sf9细胞进行表达;分别采用超声破碎、含离子型表面活性剂(1% SDS等)或含非离子型表面活性剂(0. 5% TritonX-100)的裂解缓冲液,制备细胞裂解上清;氯化铯超速离心法纯化后经动态光散射及透射电子显微镜鉴定;0. 1 μg的HPV31 L1MΔC VLP于第0和2周肌肉免疫BALB/c小鼠,第4周采集血清分析中和活性.结果 3种裂解方法制备的上清均显示HPV31 L1MΔC蛋白的特异表达,其表达量约占裂解上清总蛋白的10%;采用非离子型表面活性剂获得的裂解上清纯化后,目的蛋白纯度高,产量达11. 5 mg/L;纯化蛋白的水化分子直径为103. 3 nm,均一性好;电镜分析为直径50~60 nm的VLP.免疫血清中HPV31中和抗体滴度为1 440.结论 HPV31 L1MΔC在昆虫细胞表达体系制备的VLP产量高、免疫原性好,可用于生产含HPV31 L1 VLP的多价疫苗.

目的 在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)31型L1病毒样颗粒(virus-like particles,VLP),并初步评价其免疫原性.方法 构建HPV31 L1四拷贝重组表达质粒,电转化毕赤酵母KM71,甲醇诱导表达蛋白.将重组菌经30 L发酵罐发酵,产物分离纯化,用纯化样品免疫小鼠,采用半数有效剂量(median effectivedose,ED50)初步评价表达产物的免疫原性.结果 经双酶切鉴定,四拷贝重组表达质粒构建正确.表达产物可与小鼠抗HPV L1单抗发生特异性结合.纯化产物在透射电镜下为直径60 nm的VLP结构,相对分子质量约55 000,纯度达95％以上.小鼠体内效价ED50值为0.018μg.结论 成功在毕赤酵母中表达了HPV31型L1 VLP,其在小鼠体内具有良好的免疫原性.

目的:构建获得HPV31构象依赖的中和单抗.方法:采用昆虫细胞表达的HPV31 L1VLP (virus-like particle,VLP)免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,收集杂交瘤细胞培养上清,首先采用HPV31 VLP-ELISA及HPV31假病毒中和实验筛选分泌HPV31中和单抗的杂交瘤细胞株,然后纯化单克隆抗体,分别采用假病毒中和实验及ELISA实验对纯化后单克隆抗体进行鉴定,包括抗体的亚型及其结合表位的构象特征、针对HPV31的中和IC50及针对HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV52、HPV58、HPV6、HPV11的交叉中和活性.结果:筛选获得9株HPV31构象依赖中和单抗,其中3株HPV31特异性中和单抗中有2株的IC50＜10 ng/mL,分别是XM31-13 (0.36,IgG1)及XM31-23 (7.10,IgG1),6株交叉中和单抗中亦有2株的IC50＜10ng/mL,分别是XM31-19(7.14,IgG1)、XM31-20(6.91,IgG1).结论:获得的9株HPV31构象依赖的中和单抗,特别是其中4株单抗IC50值＜ 10 ng/mL的4株单抗,可用于含HPV31L 1VLP多价疫苗的质控疫苗的研究.

目的 人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus 16,HPV16)是引起宫颈癌的主要型别,HPV16主要衣壳蛋白L1具有激活宿主免疫细胞,诱导中和抗体产生的功能.本研究旨在探讨HPV16 L1基因变异与宫颈癌发生的关系.方法 共纳入2015-09-30-2017-03-31昆明医科大学第三附属医院妇科89例感染HPV16的宫颈癌患者(病例组)和132名感染HPV16无宫颈病变的感染者(对照组)作为研究对象.采集研究对象宫颈样本扩增HPV16 L1序列并测序,分析病例组和对照组中HPV16各亚型的分布情况以及HPV16 L1基因突变的分布情况,探讨HPV16 L1基因变异与宫颈癌之间的关系.结果 发现存在2种HPV16亚型分布,分别为亚洲型(As)和欧洲型(EUR),病例组中发现84例As亚型(94.4％),5例EUR亚型(5.6％),对照组发现122例As亚型(92.4％),10例EUR亚型(7.6％),经分析各亚型在病例组和对照组之间的分布差异无统计学意义,P=0.570.2个核苷酸的突变引起A6178C (N207T)和A7036C(K493T)氨基酸的改变,其中A6178C(N207T)突变仅发生在As亚型中,而A7036C(K493T)仅发生在EUR亚型中.结论 通过HPV16 L1基因的序列比对分析后发现,HPV16 L1基因在宫颈癌和无宫颈病变的感染者中均存在变异,本研究结果可为基于HPV L1疫苗的研发设计提供参考数据.

目的 探讨人乳头瘤病毒感染和阴道微生态状况对妇女宫颈鳞状上皮内病变(SIL)的影响.方法 选取2018年1月-2019年1月在浙江萧山医院接受治疗的SIL患者共计113例,根据患者病变程度分为低级别鳞状上皮内病变(LSIL)患者32例,高级别鳞状上皮内病变(HSIL)患者81例.分析患者HPV分型情况,并评估阴道微生态与SIL的关系.结果 113例SIL患者共检出HPV阳性患者80例,占70.80％;HPV阳性患者中占比最高的4种亚型分别为HPV16(31例,占38.75％)、HPV52(14例,占17.50％)、HPV58(8例,占10.0％)、HPV18(8例,占10.0％);HSIL患者HPV阳性率(83.95％)显著高于LS1L患者(37.50％),比较差异具有统计学意义(x2=8.628,P=0.004);HSIL组患者阴道分泌物pH值高于LSIL组患者(t=2.743,P=0.017);HSIL组患者过氧化氢浓度阳性率及乳酸杆菌阳性率显著低于LSIL组(P＜0.05),白细胞酯酶阳性率显著高于LS1L组患者(P＜0.05);高危HPV(HR-HPV)患者菌群密集度分级、菌群多样性、乳酸菌分级、需氧菌性阴道病(AV)、细菌性阴道病(BV)、外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)检出率与低危HPV(LR-HPV)患者比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 阴道微生态与HR-HPV感染关系密切,阴道菌群失调会导致宫颈HR-HPV的感染,HR-HPV可能会导致SIL进一步发展为HSIL甚至宫颈癌,提示临床对HSIL应该及时纠正阴道微生态平衡,提高患者的宫颈局部免疫,对宫颈癌的预防和治疗具有重要的临床意义.