目的 优化食管鳞癌类器官的培养方法.方法 收集郑州大学第二附属医院胸外科2023年5月至2024年3月食管鳞癌手术标本20例,用含/不含R-spondin 1的培养基培养类器官,观察二者对类器官生长的影响,同时比较市售的0.25％Trypsin-EDTA、1×Tryple和自配的组织消化液对类器官的消化效果.结果 用含/不含R-spondin 1培养基培养食管鳞癌类器官时,两者的类器官大小、生长速率无明显差别(P＞0.05).0.25％Trypsin-EDTA消化细胞球时,细胞分散状态好,所生成的细胞球的数量均多于组织消化液和1×Tryple,1×Tryple消化细胞球的效率和所生成的细胞球的数量均大于组织消化液.结论 R-spondin 1对食管鳞癌类器官的形成无明显影响;类器官传代扩增时,用0.25％Trypsin-EDTA有较好的消化效果.

目的 对比不同消化方法对原代乳鼠心肌成纤维细胞体外培养的影响,探求更高效的细胞分离、培养方法.方法 改良既往文献报道的心肌成纤维细胞分离方法,选用胶原酶、胰酶、胶原酶加胰酶消化液分别对同等数量随机挑选的同窝出生1～2 d的SD乳鼠进行心肌成纤维细胞分离,从细胞数量及活性、细胞增殖、细胞纯度及对中药、西药反应灵敏度等方面对分离出的第0代(P0)细胞及传代至第2代(P2)的细胞进行比较.结果 胶原酶消化法分离所得细胞在数量、成活率、贴壁速度、增殖速度方面,明显优于胰酶消化法或胶原酶加胰酶消化法,P＜0.05,差异有统计学意义;在形态学上并无明显差异,且细胞纯度均可达到95％;胶原酶消化法所得细胞对中药、西药灵敏度较高,P＜0.05,差异有统计学意义.结论 选用胶原酶作为原代乳鼠心肌成纤维细胞的消化酶,运用时间梯度消化细胞,可以高效得到数量多、活性好、纯度高、对药物反应灵敏的细胞.

鸡输卵管上皮细胞是卵清蛋白的主要分泌细胞,是研究输卵管特异表达蛋白调控的重要工具.在以往的研究中,多采用普通DMEM培养液对鸡输卵管上皮细胞进行分离与培养,容易造成其自身特性在体外培养过程中的改变.本研究我们优化了细胞分离方法,发现从输卵管漏斗部组织分离的输卵管上皮细胞增殖较快;用鸡输卵管上皮细胞培养基相比DMEM更适合促进细胞生长;与胰酶相比,用Accutase消化酶进行细胞传代,有利于输卵管上皮细胞特性维持.对所获得的输卵管上皮细胞鉴定发现,己烯雌酚能促进卵清蛋白的表达,说明分离培养的细胞保持了鸡输卵管上皮细胞特性.本研究建立的方法为输卵管特异表达蛋白调控以及家禽生物反应器的研究奠定了基础.

背景:脂肪间充质干细胞具有调控内分泌代谢、维持脂肪细胞周围微环境稳态、参与脂肪细胞发育等功能,在脂质代谢和肥胖症发生发展中起着重要作用.目前脂肪间充质干细胞的体外培养主要采用Ⅰ型胶原酶消化法,但其存在消化时间较长、效率低的缺点,故如何选择合适消化酶,以缩短消化时间、提高实验效率,值得关注和探索.目的:建立简单、高效的体外大鼠脂肪间充质干细胞原代培养方法,为临床开展干细胞治疗和基因治疗提供重要的细胞载体.方法:无菌条件下取出大鼠双侧腹股沟和附睾处的脂肪垫组织,用虹膜剪剪碎成糊状,加入2 mL 0.1％ Ⅱ型胶原酶消化45 min,洗涤离心后接种于含体积分数为10％胎牛血清的低糖型DMEM完全培养基中,置于CO2培养箱内进行原代培养.待细胞达80％-90％融合时,以1:3的比例进行传代培养.倒置显微镜下连续观察细胞形态变化,并对第4代目的细胞进行细胞表面标志物特异CD分子检测及成脂、成骨诱导分化实验.结果 与结论:①原代培养3 d后,少量短梭形细胞爬出;5 d后,细胞呈集落或团簇样生长,形态为长梭形;6-8 d时,细胞集落相互融合,密度达80％-90％,呈漩涡状排列;传至第3代时,细胞增殖迅速,接种48 h后即可再次传代,且细胞形态均一,呈现明显的鱼群样生长;②流式细胞仪检测结果显示CD90、CD73和CD29表达阳性,CD34、CD45和CD11b/c呈阴性表达;③第4代脂肪间充质干细胞成脂诱导7-10 d后,细胞形态逐渐由长梭形变为多边形或圆形,胞浆内积聚了大小不等的脂肪滴,经油红O染色后脂肪滴呈鲜艳深红色;而成骨诱导21 d后,细胞逐渐由长梭形变为多边形,呈聚集样生长,表面有大小不等的黑色小颗粒,局部有矿化样的结晶物;经茜素红染色后可见散在分布、大小不等的"蘑菇样"深红色球形结节;④由结果可见,该实验成功建立了一种简单、高效的大鼠脂肪间充质干细胞原代培养方法.

目的 探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSCs)对异体人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)增殖及其调节性 T 细胞(regulatory T cells,Treg)亚群的影响.方法 用组织块贴壁法培养原代hUC-MSCs,经消化酶传代培养扩增细胞,获得第4代hUC-MSCs;经Ficoll密度梯度离心法获取PBMCs.将hUC-MSCs与PBMCs以1∶5和1∶10的比例共培养,设单独培养的PBMCs为对照组,在培养体系中添加25 ng/mL植物血凝素(phytohaemaggluitinin,PHA),培养5 d;采用全自动血液分析仪检测PHA活化PBMCs数量,流式细胞仪检测CD4+CD25+CD127ddim/-Treg细胞表达水平.结果 hUC-MSCs为贴壁生长的梭形细胞,具有分化为成脂肪样细胞、成骨样细胞和成软骨样细胞的潜能.hUC-MSCs与PBMCs以1∶5和1∶10比例共培养5 d,悬浮细胞数均少于单独培养组,hUC-MSCs抑制PBMCs增殖率分别为(81.54±5.10)％和(43.37±3.35)％;hUC-MSCs 促进 CD4+CD25+CD127ddim/-Treg 细胞亚群增殖,上调效率分别为(41.73±4.66)％和(19.39±5.62)％,高于单独培养组.结论 hUC-MSCs在体外对PHA活化的异体人PBMCs有免疫负调节作用.

目的 探讨脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)对大鼠同种异体皮瓣移植的免疫调节作用.方法 自2015年9月至2017年5月,解放军总医院(解放军医学院)通过留取整形术后的脂肪组织,经剪切、消化酶消化、过滤、离心后收集单个细胞;利用贴壁培养法获得贴壁细胞,扩增传代培养ADSCs;流式细胞术检测细胞表型,添加分化培养基后检测细胞的多向分化功能;构建大鼠同种异体皮瓣移植模型,按静脉是否输注ADSCs,将大鼠分为实验组与对照组,观察各组大鼠移植皮瓣及腹股沟淋巴结的外观,检测各组大鼠移植术后3 d皮瓣的CD3阳性细胞分布情况以及腹股沟淋巴结的T细胞亚型分化情况,记录皮瓣成活时间.结果 经酶消化法提取的ADSCs,符合间充质干细胞标志特征和多向分化功能;与对照组相比,实验组大鼠移植皮瓣的颜色正常、未见明显红肿,腹股沟淋巴结外观趋于正常,移植皮瓣中CD3阳性细胞数量明显减少(P<0.05),淋巴结内Th2/Th1明显增加(P<0.05),皮瓣成活时间明显增加(P<0.05).结论 利用术后脂肪组织成功分离培养出ADSCs,操作方法简单、细胞功能稳定.静脉输注获取的ADSCs可抑制大鼠异体皮片移植后的免疫反应,ADSCs有望在组织器官再造和免疫治疗中具有良好的应用.