甘蔗是最重要的糖料作物,但甘蔗黑穗病是导致甘蔗产量降低和品质损失的最主要病害之一,严重影响糖产业的可持续健康发展.微生物防控甘蔗黑穗病是近年来快速兴起的绿色防控技术,具有环境相容性高、培肥土壤等优势.本文主要阐明了引发甘蔗黑穗病的甘蔗鞭黑粉菌特性及其侵染原理,分析了以生物有机肥和生物农药为主的甘蔗黑穗病微生物防治研究现状,系统梳理了微生物通过分泌拮抗物质、竞争营养物质和生态位、诱导植物产生系统抗性等途径抑制甘蔗黑穗病发生的作用机制,并提出了当前甘蔗黑穗病的微生物防治技术应用存在的生防菌定殖能力差和生防效果不佳问题.最后,从提高微生物高效防控甘蔗黑穗病的角度展望了未来研究的重点方向,以期为甘蔗黑穗病微生物防治研究及糖产业的健康发展提供参考.

目的 利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除4.1R基因的RAW264.7巨噬细胞株,为研究4.1R在巨噬细胞中的功能奠定基础.方法 根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别4.1R基因的向导RNA(sgRNA),构建sgRNA-lentiCRISPRv2重组质粒并转入293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒侵染RAW264.7细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并稀释至单克隆,Western blotting印记检测单克隆细胞中蛋白4.1R的表达,测序确认单克隆细胞中突变位点.结果 Western blotting印迹检测结果表明筛选出的1株单克隆细胞中蛋白4.1R的表达完全缺失;测序结果表明该细胞株中4.1R基因发生了19bp的缺失突变;并且4.1R基因敲除后,RAW264.7细胞的增殖能力显著增加.结论 本研究利用CRISPR/Cas9系统成功的干扰了巨噬细胞系RAW264.7细胞中4.1R的表达,为研究4.1R在巨噬细胞中的功能提供了有效工具.

目的 构建铜绿假单胞菌PA14细胞株的PA0745基因突变株,并验证其致病性.方法 采用同源重组原理构建铜绿假单胞菌PA0745基因缺失株和点突变株.利用质粒抗性和营养缺陷进行筛选,获得铜绿假单胞菌突变株E126A、E146A和△PA0745.分析突变PA0745基因后,PA14细胞株生长特性及致病性变化.结果 成功构建PA14细胞株的PA0745基因突变株E126A、E146A和APA0745.生长曲线测定结果表明,PA0745基因突变后,不影响PA14细胞株正常生长.细胞侵染实验结果显示,相较于PA14细胞株,E126A、E146A和△PA0745对RAW264.7侵染能力分别下降了29.51％、60.66％和79.34％.结论 本研究成功构建了PA14细胞株的PA0745基因突变株,并初步验证了PA0745基因的功能,这对开发抗菌药物有指导意义.

随着合成生物学的兴起,历史悠久的生物固氮研究领域迎来了新的发展机遇.合成生物学的原理和技术引入固氮生物学以后,诞生了固氮合成生物学的新兴交叉学科.共生固氮是生物固氮三种形式中效率最高的一种.在共生固氮体系中,固氮细菌以细胞器的面目出现在宿主植物细胞质中,利用微氧和物质能量充足的有利条件,进行较为稳定长久的固氮反应.但是,共生固氮作用的局限性在于宿主专一性,即共生固氮细菌难以在绝大多数经济作物上完成侵染和固氮作用.因此,固氮合成生物学面临的一个重要挑战是如何突破固氮细菌的宿主专一性,实现主要经济作物共生或者自主固氮.为了解决这一难题,国内外的研究者通过艰难地探索取得了良好的研究进展.本文将就固氮合成生物学的一些主要进展和面临的问题作一简要综述.

由蛋白质精氨酸甲基转移酶(Protein arginine methyltransferases,PRMTs)调控的精氨酸甲基化是真核生物中普遍存在的翻译后修饰.为研究稻瘟病菌MoHMT1(hnRNP arginine N-methyltransferase,PRMT1的同源蛋白)基因的功能,本研究根据同源重组的原理获得Mohmt1的敲除突变体,并对突变体进行了初步的表型分析.结果表明,与野生型相比,MoHMT1基因的缺失导致稻瘟病菌的菌落变小,表面气生菌丝变薄,生长速率明显减慢.虽然MoHmt1突变体的产孢量明显下降,仅为野生型的20％ 左右,但是产生的分生孢子能正常萌发产生附着胞,并成功侵入洋葱表皮细胞.进一步利用孢子悬浮液接种水稻叶片,发现Mohmt1缺失突变体病斑数显著减少,致病能力减弱.以上实验结果表明MoHMT1蛋白可能在稻瘟病菌菌丝生长发育和侵染致病过程中发挥了重要的调控作用.

微生物群体感应(QS)是其群体密度变化时,通过信号分子的产生与接收对种内或种间菌体生理代谢状况进行调节的一种现象,其本质是微生物种内或种间的信息交流.当前,受微生物侵染腐败影响,世界范围内的食品损失巨大,有大量证据表明群体感应现象参与食品腐败过程,因此掌握微生物群体感应现象的基本规律对食品防腐保鲜与减少食物浪费有重要意义.基于此,笔者简要梳理了微生物群体感应的基本概念与原理,列举了食品腐败中部分常见的群体感应现象和部分群体感应抑制剂的研究,并提出合理性建议,以期为群体感应在食品领域的研究提供理论依据与支持.

目的:为了追踪疟原虫发育及侵染的情况,构建及筛选胞浆稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的伯氏疟原虫.方法:构建含有伯氏疟原虫230p基因和GFP基因的重组质粒pL0035-GFP,质粒线性化后通过电转染转入野生型伯氏疟原虫;基于双交换同源重组原理,利用乙胺嘧啶筛选获得在230p基因处插入GFP的重组疟原虫;有限稀释法筛选表达GFP的单克隆重组伯氏疟原虫;PCR鉴定重组疟原虫基因型,荧光显微镜和流式细胞术检测GFP表达情况.结果:PCR及DNA测序结果表明GF基因成功整合到伯氏疟原虫基因230p;荧光显微镜可观察到重组疟原虫胞浆呈绿色荧光,流式细胞术检测到绿色荧光信号.结论:成功构建胞浆表达绿色荧光蛋白的伯氏疟原虫.

[目的]由果生炭疽菌引起的炭疽病是油茶的主要病害,造成油茶产量下降.本文研究果生炭疽菌中丝裂原活化蛋白激酶CfMkk1的生物学功能,旨在为解析油茶炭疽病菌的致病机理提供依据.[方法]根据同源重组原理构建CfMKK1基因敲除载体片段,采用PEG介导法将载体导入原生质体中筛选获得突变体菌株△Cfmkk1;PCR扩增果生炭疽菌含有启动子的CfMKK1基因回补片段,构建回补载体pYF11::CfMKK1;采用PEG介导法把回补载体转化至突变体的原生质体中,荧光筛选回补菌株△Cfmkk1-C.测定野生型菌株、突变体菌株△Cfmkk1及基因回补菌株△Cfmkk1-C在营养生长、附着胞形成、胁迫应答和致病力等生物学表型.[结果]与野生型和回补菌株相比,CfMKK1基因敲除突变体△Cfmkk1菌丝生长速率明显减缓;在含刚果红的PDA培养基上菌丝生长受到明显抑制,无法穿透玻璃纸,丧失了侵染寄主的能力;而且无法形成附着胞.[结论]研究结果表明CfMKK1基因参与调控油茶果生炭疽菌的生长发育、附着胞形成、致病力以及响应外界胁迫过程..

原子力显微镜是1986年发明的一种用于观察样品表面纳米级三维结构的显微技术.近年来,越来越多的生物研究中开始使用原子力显微镜对生物样品的微观结构进行研究.与光学显微镜和电子显微镜的成像原理不同,原子力显微镜的观察主要依靠纳米级的探针对样品表面进行接触式扫描,无需对样品进行染色、包被处理即可获得样品三维高分辨率图像,同时还可以利用纳米探针对样品进行力学以及其它微操作,从而提供更多的生物特性与信息.黄单胞菌属致病菌是一类有广泛寄主范围的致病菌,其侵染对象涵盖众多瓜果、蔬菜,甚至水稻、木薯等粮食作物,危害极大.对黄单胞菌的功能基因组研究方兴未艾,然而,对黄单胞菌突变体的高分辨率个体表型观察、菌体解剖研究一直是空白.本研究利用原子力显微镜成功地对十字花科黑腐病病菌Xcc 8004菌株进行了表面结构观察,并对戊二醛固定样本进行了表面超微解剖,为黄单胞菌的功能基因研究提供了新颖的表型观察和研究手段.

目的:通过对尖孢镰刀菌中Folprp4基因的鉴定,揭示其在尖孢镰刀菌中的功能及致病相关性.方法:基于同源重组原理,根据测定出的Folprp4基因序列,应用Split-Marker重组技术构建含有潮霉素抗性基因(hph)的基因缺失盒.将基因缺失盒经PEG介导转化到野生型原生质体中,在含有潮霉素B的TCC培养基上筛选转化子,通过PCR正负筛查获得Folprp4基因缺失突变株(AFolprp4).构建含有Folprp4基因的载体pZDH1,并将其转化到敲除突变体中进行互补测验.结果:与野生型(hm)和异位插入突变体(ecFolprp4)相比,敲除突变体菌丝生长受到严重阻碍,当野生型和异位插入突变体长满整个平板时,敲除突变体菌落呈小点状.敲除突变体的另一个显著变化是△Folprp4的分生孢子产量显著下降.侵染实验表明,△Folprp4对亚麻幼苗的毒力显著降低.互补实验表明,该互补载体的回复子(Folprp4-C)在菌落形态、生长速率、分生孢子产量和毒力方面均恢复到了野生型菌株.结论:Folprp4基因与尖孢镰刀菌的菌丝生长、分生孢子发生和致病性有关.