目的:利用转录组测序(RNA-seq)和生物信息学技术对低氧与常氧条件下人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞的差异表达基因(DEGs)及信号通路的变化进行分析，探讨低氧诱导ARPE-19细胞损伤的生物学机制。方法:将ARPE-19细胞分为低氧处理组和常氧对照组，分别采用体积分数1%和21% O 2处理细胞8、24、48、72 h，采用实时荧光定量PCR法检测不同时间点血管内皮生长因子(VEGF)和低氧诱导因子(HIF-1α)mRNA相对表达量。分别对2个组处理后8 h和24 h的ARPE-19细胞进行RNA-seq及生物信息学分析，以|log 2FC|≥1且 P≤0.05为条件筛选出DEGs，并对DEGs进行聚类热图分析、基因本体论(GO)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析及蛋白-蛋白互作(PPI)网络分析。采用实时荧光定量PCR法检测低氧处理ARPE-19细胞24 h后DEGs中可能与低氧有关的基因mRNA相对表达量。采用细胞活力检测试剂盒验证2个组不同时间点低氧对ARPE-19细胞的损伤作用。 结果:低氧处理组8、24、48、72 h VEGF和低氧处理组8、24、48 h HIF-1α mRNA相对表达量均高于常氧对照组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)，其中低氧处理后8 h和24 h各因子mRNA表达差异较大。低氧诱导8 h，低氧处理组与常氧对照组间筛选显著DEGs共62个，其中显著上调基因45个，显著下调基因17个；低氧诱导24 h，2个组间筛选显著DEGs共255个，其中显著上调基因228个，显著下调基因27个。DEGs的GO功能分析主要富集在蛋白质降解、核苷酸生物合成及物质转运等进程。KEGG通路分析主要富集在PI3K-Akt、cGMP-PKG以及其他与代谢、细胞周期、细胞生长和细胞凋亡密切相关的信号通路。PPI网络分析发现核心基因 HPCA、 MT3和 NOS3等。实时荧光定量PCR检测结果示，低氧处理ARPE-19细胞24 h后，低氧相关基因 DEPP1、 NPPB、 PDZK1、 HILPDA、 TCEA3、 NDRG1和 RORC的mRNA表达水平升高， TFRC、 NQO1的mRNA表达水平降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。低氧诱导ARPE-19细胞后8 h和24 h，细胞形态均正常，生长状态较好，未出现死亡细胞，低氧诱导48 h后ARPE-19细胞出现死亡，低氧诱导72 h后死亡细胞数量增加。 结论:与代谢相关的PI3K-Akt、cGMP-PKG信号通路可能参与低氧诱导的ARPE-19细胞损伤作用， HPCA、 MT3、 NOS3核心基因可作为功能性靶基因，在低氧反应中起到关键作用。

内质网是膜蛋白和分泌蛋白合成新肽链以及新肽链初步折叠修饰的重要场所,只有经过二硫键形成、羟基化以及糖基化等修饰的肽链正确折叠后才能达到其正确蛋白质构象,或进入高尔基体进行进一步的修饰和折叠.然而,折叠和修饰的过程是复杂且易错的,如果生命体遭受某些内源或外源的压力,出错概率会成倍增加.错误折叠的蛋白质由内质网中的质量检测系统识别并滞留在内质网内,一旦错误蛋白积累量超过内质网的承受能力,就会引起细胞一系列的响应以实现新的内质网稳态,这个过程称为内质网应激反应,也称内质网胁迫应答.重新实现内质网稳态的方法主要有非折叠蛋白反应、内质网相关的蛋白质降解过程、自噬过程以及细胞凋亡.这些过程在酵母和动物领域的研究已经非常系统,主要总结了这些过程在高等生物中的保守作用机制以及在植物领域的研究进展,希望能够为致力于植物生长发育或胁迫响应过程的研究人员提供参考.

内质网应激是普遍存在于真核细胞中的应激-防御机制.在内环境稳态遭到破坏的情况下,未折叠蛋白质反应的3条信号通路,分别通过增强蛋白质折叠能力、减少蛋白质生成和促进内质网相关蛋白质降解等途径缓解细胞内压力.同时,也通过多种分子信号机制调控细胞凋亡.自噬是一种生理性的降解机制.通过形成自噬泡并与溶酶体结合摄取并水解胞内受损细胞器和蛋白质等,清除代谢废物,维持细胞正常功能.自噬缺陷或过度激活均可导致细胞凋亡或非程序性死亡.自噬的程度和细胞内压力水平有关.内质网应激通过未折叠蛋白质反应和Ca2+浓度变化及其相关分子信号调控自噬.自噬又可反馈性调节内质网应激反应,二者相互作用,在内皮细胞凋亡过程中发挥重要作用.未来内质网应激和自噬可作为药物靶点为内皮相关性疾病提供诊疗策略.

泛素-蛋白酶体系统是真核细胞内重要的蛋白质降解系统,参与调节细胞周期、基因转录、抗原递呈、细胞增生与分化以及信号转导等各种病理生理过程.泛素-蛋白酶体功能异常与肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病等多种疾病致病机制相关.近年来,越来越多的研究也证实泛素-蛋白酶体系统存在于视网膜中,一些视网膜损伤在退行性疾病人群中同步出现.泛素-蛋白酶体系统参与视网膜氧化应激、炎症反应、血管新生、神经损伤、信号转导等病理生理过程.在糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性等疾病的发生和发展过程中,核因子κB(NF-κB)、转化生长因子-β(TGF-β)、活性氧簇(ROS)等一些信号通路起重要作用,其蛋白质的降解和合成失衡对视网膜疾病的病理生理过程产生重大影响.应用蛋白酶体抑制剂可以减轻网膜病变炎症等病理改变.本文对泛素-蛋白酶体系统在视网膜病变中的作用及机制进行综述.

内质网应激和自噬是两把双刃剑,当细胞内环境紊乱时,未折叠蛋白质反应通过3条信号通路来减少蛋白质合成、促进蛋白质降解、增加蛋白质折叠以恢复细胞内稳态,过度应激则会激活一系列信号分子诱导细胞凋亡;自噬是人体自我降解保护途径,通过自噬泡-溶酶体复合物摄取并分解胞内受损或有害的大分子物质,促进细胞新陈代谢,而过度自噬亦会引起细胞凋亡.内质网应激和自噬在肝细胞凋亡过程中发挥重要作用.因此,二者可作为未来药物研究靶点,为肝细胞相关性疾病提供诊疗策略.

在真核生物中,核膜由双层磷脂分子层组成,这是真核生物区别于原核生物的一大特征.外核膜与内质网相连,内核膜上则有许多特异的蛋白,核孔复合体横跨分隔着内外核膜.内核膜相关的蛋白质降解(INMAD),主要通过泛素蛋白酶体途径,介导错误折叠或错误定位到核内的蛋白的降解,或调控核膜蛋白的分布,是近年来发现的核内蛋白质量控制新领域.INMAD与内质网相关的蛋白质降解(ERAD)有许多相同之处,ERAD的研究较多,但INMAD的机制仍有很多空白.该文总结了三种泛素连接酶介导的INMAD: Asi1/3、Doa10、APC/C.三者在经典底物、底物识别和泛素化降解过程有所不同.同时该文讨论了INMAD在维持内核膜平衡中的作用,随着INMAD研究的不断深入,可能为内核膜相关疾病的发现与修复提供策略.

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是常见的中枢神经系统退行性疾病之一,其主要病理学特征是中脑黑质部的多巴胺(dopamine,DA)能神经元选择性丢失.虽然已发现基因易感性、衰老、环境毒素等因素与PD发病有关,但导致DA能神经元退行性死亡的细胞分子机制仍不明确.DA代谢是DA能神经元中的重要生理过程,其过程与黑质DA能神经元丢失密切相关,DA代谢异常参与了PD神经元变性相关的诸多病理学过程,例如铁代谢异常、α-突触核蛋白异常聚集、内质网应激、蛋白质降解功能障碍、神经炎症反应等.本文就DA代谢异常在PD相关病理学过程中的作用进行综述.

内质网应激是细胞应对蛋白质突变和表达水平异常的防御性反应,包括未折叠蛋白反应(UPR)、内质网相关蛋白质降解(ERAD)和自噬体形成等多个组成部分.许多研究指出,肿瘤细胞依赖高水平的内质网应激反应以维持生存和高速生长,干扰UPR和ERAD可抑制肿瘤细胞的生长.同时,癌细胞发生抗药的关键机制是产生新的突变,这些突变可能会进一步诱导UPR和ERAD等,使抗药癌细胞对内质网应激的抑制剂更加敏感.因此,面对后基因组时代发现的肿瘤细胞突变的多样性、异质性和持续性,靶向细胞对突变的反应——内质网应激,是值得关注和研究的新抗肿瘤策略.

糖尿病血管病变是糖尿病较严重的慢性并发症之一.在高糖状态下,血管正常功能受到损害的同时常常会引起一系列血管并发症,如:糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、下肢动脉硬化闭塞、主动脉瘤等.而近来的研究表明,自噬作为一种细胞内蛋白质降解途径和一种机体防御机制,在糖尿病血管病变中发挥着重要作用.此文章综述了自噬相关分子、糖尿病自噬调控途径以及自噬在糖尿病相关血管病变中的不同作用,并对自噬参与糖尿病血管病变的机制进行了深入探讨,提出了靶向自噬的机制研究可能会开辟一个新的治疗糖尿病血管病变途径的学说.

目前,已知超过150种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(glycosylphosphatidylinositol anchored pro-tein,GPI-anchored protein)在哺乳动物细胞中表达,并参与免疫识别、细胞通讯与信号转导等多种生理过程.当蛋白质无法被GPI修饰时,前体蛋白质通过内质网相关蛋白质降解(endoplasmic re-ticulum associated degradation,ERAD)途径降解.然而,GPI锚定蛋白ERAD的降解机制尚不清楚.为了探究GPI锚定蛋白前体的ERAD途径的具体机制,本研究敲除人胚胎肾细胞293细胞株(HEK293)的GPI转酰胺酶复合物亚基PIGS基因,进而敲除E3泛素连接酶HRD1和GP78基因,之后随机在PIGS-KO,PIGS-HRD1-KO和PIGS-GP78-KO过表达16种GPI锚定蛋白质(以亲本PIGS-KO细胞株作为对照组),Western印迹结果证明,GPI锚定蛋白前体在细胞株PIGS-HRD1-KO中的蛋白质积累量(IPHK)和PIGS-GP78-KO中的蛋白质积累量(IPGK)体现出明显的差异性,例如LYPD2的IPHK是IPGK的28倍,NEGR1的IPHK 是 IPGK的0.12倍,这说明GPI锚定蛋白前体的降解主要依赖于2种ERAD途径:ERAD-L和ERAD-M.且HRD1与GP78的2种E3泛素连接酶被选择性地用于GPI锚定蛋白前体的降解.朊病毒(prion)和CD59嵌合构建体表明,GPI前体蛋白C-端GPI附着信号决定了降解途径(朊病毒IPHK/IPGK由突变前的0.33改变为突变后的23.42.相反的是,突变前CD59的IPHK/IPGK是11.45,突变后变为2.81).接着,通过对C-端附着信号疏水性的计算,我们发现,这种选择性差异由前体蛋白质C-端GPI附着信号疏水性的不同造成.本研究初步解释了未被GPI锚修饰的GPI锚定蛋白前体在ERAD中的降解机制.