[目的]NRAMP(natural resistance-associated macrophage protein)基因家族是一类广泛存在于植物中的天然抗性相关巨噬蛋白,对植物中二价金属离子的细胞转运具有关键作用.为挖掘沙棘NRAMP基因家族响应重金属铅胁迫的关键基因,阐明沙棘响应重金属铅胁迫的分子机制.[方法]利用生物信息学技术鉴定沙棘NRAMP家族成员,对编码该家族蛋白的理化性质、系统进化、基因结构、保守基序、顺式作用元件、不同浓度铅胁迫下的NRAMP基因表达谱、种内种间共线性、蛋白互作网络进行综合分析.[结果]NRAMP基因家族的 11 个成员不均匀分布于 7 个染色体上,被分为Group1-Group3 三大类群.NRAMP基因家族成员的启动子具有丰富的激素应答、分生组织表达和环境应激响应元件.转录组分析表明,沙棘NRAMP基因家族的 11 个成员在不同浓度的铅离子胁迫下呈现差异表达,其中 8 个基因在 1 000 mg/kg的铅胁迫下显著下调,7 个基因在高浓度铅胁迫(5 000 mg/kg)下表达上调,并对选定的 6 个沙棘NRAMP基因进行了RT-qPCR验证.沙棘与单子叶植物小麦NRAMP基因家族的种间共线性比率高于双子叶植物拟南芥.蛋白质互作网络分析表明,沙棘NRAMP基因家族成员HrLNRAMP8 可能主要通过乙烯途径调控重金属的吸收转运.[结论]在全基因组范围内从沙棘中系统鉴定得到 11 个HrLNRAMP家族成员.Group2 亚族成员基因结构最复杂且一致性较低;所有的沙棘NRAMP成员都含有NRAMP家族特有的转运基序motif1.不同基因家族成员在铅胁迫条件下的表达具有偏好性,该基因家族通过响应重金属铅离子胁迫来调控基因表达水平,从而降低重金属胁迫带来的伤害.

炭疽病是油茶的主要病害,造成巨大经济损失.果生刺盘孢是油茶炭疽病优势致病菌.本研究旨在探讨果生刺盘孢中组蛋白乙酰化转移酶Rtt109的生物学功能,为油茶炭疽病防治提供理论依据.通过构建基因敲除载体,根据同源重组原理,敲除目标基因CfRTT109,进一步筛选获得突变体ΔCfrtt109;构建CfRTT109基因回补质粒,转化至突变体ΔCfrtt109,通过荧光筛选回补菌株.生物学表型测定结果显示:相比于野生型,突变体ΔCfrtt109生长速率下降了 51.23％,分生孢子的形成率下降了 71.89％;在含有5.0 mmol/L内质网胁迫剂二硫苏糖醇的PDA培养基中,突变体ΔCfrtt109的生长抑制率为50.75％,显著高于野生型和回补菌株;荧光定量PCR结果表明,与野生型和回补菌株相比,内质网相关的基因HAC1、SCJ1与PDI1基因在突变体中显著上调表达;在含有DNA损伤试剂甲基磺酸甲酯的PDA培养基中,突变体ΔCfrtt109停止生长;进一步研究发现,在甲基磺酸甲酯胁迫下,突变体ΔCfrtt109中的DNA损伤修复基因RHM52、RHM54与REV1表达量上调幅度显著低于野生型;致病力测定结果显示,突变体ΔCfrtt109在油茶叶上形成的病斑面积减小了 77.60％,在苹果上减少了 89.91％.综上所述,组蛋白乙酰化转移酶CfRtt109参与调控果生刺盘孢营养生长、分生孢子形成、内质网胁迫和DNA损伤胁迫应答以及致病力.

植物蜡酯合成酶催化长链醇和长链脂肪酸合成蜡酯,对植物蜡质合成及其抗旱、抗致病菌袭击和紫外辐射、抗寒和昆虫侵害等环境胁迫具有非常重要的作用;镉是环境中含量最高的有毒重金属之一,严重威胁植物的生长发育、质量、产量和食用安全.为研究地黄蜡酯合成酶基因镉胁迫表达,该文从地黄全长转录组测序数据中鉴定其成员,并用生物信息学技术与qRT-PCR对其编码蛋白质的理化性质、系统进化和保守结构域及其组织表达与镉胁迫表达进行分析.结果表明:(1)鉴定出两个蜡酯合成酶基因RgOATWSD1 与RgOATWSD2,其编码蛋白质的长度、理论等电点和相对分子量依次为 463 aa与 473 aa、8.86 与 9.34、51.31 kD与 52.49 kD,均为不稳定蛋白.(2)二者均具有acyl_WS_DGAT保守域与DUF1298 超家族,前者占其氨基酸序列的 92.65%～94.50%.(3)二者均定位于内质网中,二级结构以无规卷曲与 α 螺旋为主;RgOATWSD1 为跨膜蛋白,而RgOATWSD2 不是.(4)二者均在地黄根、茎、叶中差异表达.(5)二者表达均受镉胁迫诱导,但其表达变化趋势不同.该研究鉴定了两个镉胁迫应答反应的蜡酯合成酶基因,为地黄RgOATWSD的镉胁迫表达及功能研究奠定了基础.

内质网是膜蛋白和分泌蛋白合成新肽链以及新肽链初步折叠修饰的重要场所,只有经过二硫键形成、羟基化以及糖基化等修饰的肽链正确折叠后才能达到其正确蛋白质构象,或进入高尔基体进行进一步的修饰和折叠.然而,折叠和修饰的过程是复杂且易错的,如果生命体遭受某些内源或外源的压力,出错概率会成倍增加.错误折叠的蛋白质由内质网中的质量检测系统识别并滞留在内质网内,一旦错误蛋白积累量超过内质网的承受能力,就会引起细胞一系列的响应以实现新的内质网稳态,这个过程称为内质网应激反应,也称内质网胁迫应答.重新实现内质网稳态的方法主要有非折叠蛋白反应、内质网相关的蛋白质降解过程、自噬过程以及细胞凋亡.这些过程在酵母和动物领域的研究已经非常系统,主要总结了这些过程在高等生物中的保守作用机制以及在植物领域的研究进展,希望能够为致力于植物生长发育或胁迫响应过程的研究人员提供参考.

沙冬青属植物具有抗寒、抗旱、抗盐碱等特性,是研究植物逆境胁迫和筛选天然抗逆基因库的理想材料.非生物胁迫是限制沙冬青属植物生长发育及地理分布的重要因素,研究沙冬青属植物响应非生物胁迫的蛋白质组学为发掘其相关抗逆蛋白质及探索抗逆机理奠定基础.通过对近年来国内外利用蛋白质组学技术研究沙冬青属植物应答逆境胁迫的相关成果进行总结归纳,综述沙冬青属植物对低温、干旱、高盐等非生物胁迫响应的蛋白质组学最新研究进展,探讨在非生物胁迫下沙冬青属植物蛋白质水平的动态变化,揭示特定的蛋白质网络以及相关逆境应答机制,并对蛋白质组学技术应用前景进行展望,以期为沙冬青属植物抗逆分子机制更深入、全面的研究提供参考依据.

随着全球气候变暖加剧,农作物面临更加严峻的高温威胁.高温胁迫影响作物生长发育各个阶段,其中花粉发育过程对高温胁迫最为敏感,因此花粉高温应答机制成为当前植物学研究热点.研究表明,花粉可以通过质膜上的钙离子通道、内质网中的未折叠蛋白反应、活性氧积累以及H2A.Z等机制感知高温胁迫,并通过调控热激蛋白表达、糖代谢、激素水平及活性氧清除能力适应高温胁迫.该文从高温对花粉发育的影响、花粉高温胁迫应答机制以及花粉高温胁迫研究的实验设计等方面进行综述,旨在为相关研究提供借鉴.

胁迫相关基因的表达导致代谢物的积累和生化与生理途径的改变,对于植物适应不利胁迫条件至关重要.通过研究马铃薯StSRP1的结构和在逆境胁迫中的表达情况,为验证马铃薯StSRP1在抵抗生物胁迫过程中的作用奠定了基础.运用电子克隆法获得StSRP1全长序列,利用生物信息学分析StSRP1的核酸序列、氨基酸序列、蛋白质结构和启动子,基于NCBI数据库,选取20条与StSRP1匹配度高的胁迫相关蛋白序列构建了系统进化树,对不同物种间的SRP蛋白进行比对.经ABA、MJ和病菌的诱导,对StSRP1进行qRT-PCR分析.克隆获得StSRP1全长867 bp,可编码288个氨基酸,无信号肽序列,无跨膜区,有34个可能的磷酸化位点,亲水性蛋白,定位于内质网.StSRP1的表达受ABA、MJ和病菌的调控.StSRP1可能参与马铃薯逆境胁迫应答过程

[目的]蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)是一种能够侵染中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫的致死性真菌病原.微小RNA (microRNA,miRNA)可通过在转录后水平靶向抑制或降解mRNA而参与宿主与病原互作过程.本研究旨在对球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道的差异表达miRNA (DEmiRNA)及其靶基因进行深入分析,进而揭示DEmiRNA在中蜂响应球囊菌胁迫应答过程中的作用.[方法]利用Illumina MiSeq平台对正常及球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道(AcCK和AcT)进行测序,通过相关生物信息学软件预测DEmiRNA及其靶基因.通过Blast将靶基因注释到GO和KEGG数据库.利用Cytoscape软件构建DEmiRNA与其靶mRNA的调控网络.通过Stem-loop RT-PCR和qPCR验证测序数据的可靠性.[结果]本研究共预测出537个miRNA,其长度分布介于16-35 nt之间,且不同长度的miRNA首位碱基偏向性差异明显.通过Stem-loop RT-PCR证实了10个novel miRNA的表达.AcCK vs AcT比较组共有54个DEmiRNA,包含3 1个上调和23个下调miRNA,可分别靶向结合6170和8199个靶基因.GO分类结果显示上调和下调miRNA的靶基因分别涉及47和47个条目,富集基因数最多的皆为结合细胞进程和催化活性.KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果表明上调和下调miRNA的靶基因分别富集在134和126条pathway,富集基因数最多的均为内吞作用和内质网中的蛋白质加工.调控网络分析结果表明,DEmiRNA及其靶mRNA形成十分复杂的调控关系;31个DEmiRNA可靶向结合51个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNA,18个DEmiRNA可靶向结合14个与Jak-STAT信号通路相关的mRNA;miR-1277-x、miR-26-x、miR-27-y、miR-30-x、miR-6052-x等16个miRNA共同参与了上述两条免疫通路的调控.最后,随机挑选3个DEmiRNA进行qPCR验证,结果证明了测序数据的可靠性.[结论]本研究提供了中蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示了球囊菌与宿主之间在miRNA组学水平存在复杂的互作.miR-6052-x和miR-1277-x作为调控网络的核心可能通过影响细胞凋亡参与宿主的免疫防御,miR-26-x和miR-30-x可能通过调控Jak-STAT信号通路参与宿主的胁迫应答.本研究筛选出的关键DEmiRNA有望作为治疗白垩病的分子靶标.

目的 利用转录组学方法研究高温环境对德国小蠊基因表达的影响,以及这些基因的功能富集类别和参与代谢通路,进而推测德国小蠊的高温应答分子机制.方法 以25℃环境为对照,对40℃高温处理2h的德国小蠊成虫进行转录组测序,计算差异表达基因,利用Gene Ontology database基因功能富集数据库和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)基因及基因组京都信息数据库分析基因功能富集和代谢途径.结果 测序数据经筛选后,得到93725712个读序,计算生成高温应答上调表达基因524个、下调表达基因525个.高温应答基因功能富集到14个类别和30个KEGG代谢途径,基因分类包括真菌防御反应、胁迫应答、苯丙氨酸4单加氧酶活性、L苯丙氨酸分解代谢、细胞外区、色氨酸5单加氧酶活性、芳香化酶活性、铁离子结合、氨基酸结合、膜结合细胞器、内质网膜、氧化还原酶活性、羧酸酯水解酶活性和信息素应答等方面.结论 德国小蠊可能从真菌防御反应、胁迫应答等几个方面应对高温胁迫,为揭示德国小蠊高温应答和耐受分子机制提供基础.

[目的]通过深度测序和组学分析在small RNA组学层面揭示意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的免疫应答机制.[方法]利用small RNA-seq技术对正常及N.ceranae胁迫7d和10d的意蜂工蜂中肠(Am7CK、Am7T、Am10CK和Am10T)进行深度测序.利用相关生物信息学软件对测序数据进行质控、已知microRNA (miRNA)鉴定、新miRNA预测及miRNA的结构特征分析.通过Stem-loop RT-PCR验证新miRNA的表达.按照|log2(Fold change)≥1和P≤0.05的标准筛选出Am7CK vs.Am7T和Am10CK vs.Am10T比较组的差异表达miRNA (differentially expressed miRNA,DEmiRNA).利用软件预测DEmiRNA靶向结合的mRNA并进行GO和KEGG数据库注释,根据注释信息对细胞和体液免疫相关通路及富集靶mRNA进行统计和分析.根据靶向结合关系构建DEmiRNA和免疫通路相关差异表达mRNA (differentially expressed mRNA,DEmRNA)的调控网络.采用RT-qPCR对数据的可靠性和DEmiRNA的差异表达进行验证.[结果]共获得165895574条原始读段和132028990条有效序列标签,各组的组内Pearson相关性平均在87.92％及以上.共鉴定到928个已知miRNA和56个新miRNA.这些miRNA的长度介于18-28 nt,多数的长度为18 nt和22 nt且首位碱基主要偏向U.验证了12个新miRNA的真实表达.Am7CK vs.Am7T比较组包含48个上调miRNA和36个下调miRNA;Am10CK vs.Am10T比较组包含56个上调miRNA和51个下调miRNA.两个比较组的DEmiRNA可分别靶向结合9827个和10720个mRNA.这些靶mRNA可分别注释到50和47条功能条目,以及138和135条KEGG通路.DEmiRNA与免疫通路相关靶mRNA的调控网络分析结果显示,Am7CK vs.Am7T中有26个DEmiRNA靶向与内吞作用等免疫通路相关的10个DEmRNA;Am10CK vs.Am10T中有15个DEmiRNA靶向与MAPK信号通路等免疫通路相关的10个DEmRNA.验证了测序数据和4个DEmiRNA差异表达的可靠性.[结论]研究结果揭示了宿主DEmiRNA可能通过调控物质和能量代谢、细胞和体液免疫对N.ceranae产生应答,但DEmiRNA不参与抗菌肽基因的表达调控;miR-1-z可能参与宿主的细胞增殖、细胞凋亡和免疫进程;氧化磷酸化通路可能在宿主免疫应答及宿主-病原互作中发挥特殊作用.