目的:探究锰诱导的BV2细胞炎症活化是否与线粒体自噬有关.方法:小鼠小胶质细胞BV2予以不同浓度锰暴露(0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L)12 h,并以1 μg/mL脂多糖(LPS)为阳性对照组;刃天青法检测细胞活性;荧光探针检测溶酶体数量及荧光强度变化;透射电镜观察自噬变化;共聚焦显微镜观察溶酶体和线粒体荧光共定位的程度;蛋白免疫印迹(western blotting)实验检测不同浓度锰暴露12h后细胞炎症蛋白NLRP3、自噬相关蛋白(p62、LC3-Ⅱ/Ⅰ)以及线粒体外膜蛋白VDAC1的表达水平;线粒体自噬抑制剂巴弗洛霉素A1预处理验证锰暴露对自噬流及上述炎症标志蛋白表达的影响.结果:BV2细胞染锰浓度≥50 μmol/L时,BV2细胞存活率下降,NLRP3表达上调(P<0.01),溶酶体数量及与线粒体共定位显著增加(P<0.05);锰暴露组VDAC1和自噬标志蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达水平下降,p62的蛋白表达水平升高(P<0.05);巴弗洛霉素A1预处理后,显著逆转除p62外的其他自噬标记蛋白表达(P<0.05).结论:50～100 μmol/L染毒剂量下,锰诱导BV2细胞炎症活化和线粒体自噬增加;巴弗洛霉素A1抑制线粒体自噬可促进锰暴露诱导的BV2细胞炎症活化.

目的 研究(R)-(+)-长叶薄荷酮对耐药结核分枝杆菌体外抑制作用及其生物被膜调控基因Rv0024、Rv2872、Ra1362的影响.方法 通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)筛选含生物被膜调控基因Rv0024、Rv2872、Ra1362的耐药结核分枝杆菌,采用刃天青显色法和液体培养计数法测定(R)-(+)-长叶薄荷酮对生物被膜介导的耐药结核分枝杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibit concentration,MIC)和最低杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC),应用反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测(R)-(+)-长叶薄荷酮对耐药结核分枝杆菌生物被膜调控基因Rv0024、Rv2872、Ra1362的影响.结果 在3×107 CFU/mL和3×106 CFU/mL菌液浓度下,刃天青显色法测得(R)-(+)-长叶薄荷酮对耐药结核分枝杆菌的MIC和MBC分别为14.79、29.59 mg/mL;液体培养计数法测得(R)-(+)-长叶薄荷酮对耐药结核分枝杆菌的 MIC90 和 MBC分别为19.89、24.62 mg/mL.RT-PCR法结果表明长叶薄荷酮可抑制Rv0024、Ra1362的表达,促进Rv2872的表达(P<0.05).结论 ?-(+)-长叶薄荷酮通过调控耐药结核分枝杆菌生物被膜主要基因Rv0024、Rv2872、Ra1362的表达,达到抑制耐药结核分枝杆菌的生长的作用.

目的 建立一种基于刃天青显色的淋病奈瑟菌药敏试验方法并对其进行评价.方法 在肉汤微量稀释法的基础上,添加刃天青作为活细菌指示剂,采用参考株WHO G 进行试验以优化加入刃天青后细菌的培养时间,肉眼观察颜色变化以读取结果.用琼脂稀释法(金标准)和刃天青微量稀释法对3株淋球菌参考株和32株分离株分别进行阿奇霉素、头孢曲松和大观霉素最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的测定,从基本一致性(essential agreement,EA)(反映对MIC值的一致性)、分类一致性(category agreement,CA)(反映对耐药、中介和敏感判定的一致性)、极重大误差(very major error,VME)(反映假敏感性)和重大误差(major error,ME)(反映假耐药性)等指标进行分析,评价刃天青微量稀释法用于淋球菌药敏试验的准确性.CA率和EA率≥90%,VME率和ME率≤3%被认为是可接受的标准.结果 加入刃天青后反应6 h读取的结果与琼脂稀释法一致,以此参数建立刃天青微量稀释法.刃天青微量稀释法测量阿奇霉素、头孢曲松和大观霉素MIC结果的EA率分别为97.1%、91.5%和94.3%,CA率分别为88.6%、94.3%和94.3%,VME率均为0%,ME率分别为11.4%、5.7%和5.7%.结论 本研究建立的刃天青微量稀释法用于测量抗生素对淋病奈瑟菌MIC时,与琼脂稀释法具有良好的一致性,敏感结果可信度极高,仅通过肉眼观察即可方便读取结果.但应慎重对待耐药结果,需要继续进行参数的优化.

目的·探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)多聚磷酸盐激酶2(polyphosphate kinase 2,PPK2)核酸适配体对体外MTB的抑菌效果.方法·运用生物信息学方法分析MTB PPK2与呼吸道部分常见病原菌的同源性,构建PPK2进化树.通过酶联寡核苷酸分析(enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)测定PPK2核酸适配体与MTB标准株H37Rv、卡介苗(BCG)、耻垢分枝杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的结合亲和力.将PPK2核酸适配体加入血清中孵育24 h,运用琼脂糖凝胶电泳分析其在血清中的生物稳定性.采用微量刃天青显色法测定PPK2核酸适配体对H37Rv的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC).将H37Rv与1μ.mol/L的PPK2核酸适配体在罗氏培养基上培养10d,观察菌落生长情况.运用酶标仪测定与不同浓度的PPK2核酸适配体共培养10d后H37Rv菌液的D(600 nm)值,观察PPK2核酸适配体对H37Rv生长的影响.结果·生物信息学方法构建的PPK2进化树显示,H37Rv的PPK2蛋白与呼吸道部分常见病原菌亲缘性较远,与铜绿假单胞菌亲缘关系相对较近.ELONA测定结果显示PPK2核酸适配体能与H37Rv选择性结合.琼脂糖凝胶电泳分析显示PPK2核酸适配体在血清中至少稳定存在8h.PPK2核酸适配体对H37Rv的MIC为50 nmol/L.罗氏培养基菌落生长结果显示PPK2适配体对H37Rv生长具有抑制作用.生长抑制试验表明随着PPK2核酸适配体浓度增加,H37Rv的D(600 nm)呈现下降趋势,说明PPK2核酸适配体对H37Rv生长存在抑制作用.结论·PPK2核酸适配体对体外H37Rv表现出良好的抑菌活性.

目的 了解青蒿琥酯(artesunate,ASN)单独或联合利福平(rifampicin,RFP)、异烟胼(isoniazid,INH)、链霉素(streptomycin,SM)、氧氟沙星(ofloxacin,OFLX)等抗结核药物对耐药结核分枝杆菌的抑制作用,为耐药结核的治疗寻找新的有效药物提供依据.方法 采用刃天青法检测ASN对耐药结核分枝杆菌的抑制作用,并采用ASN联合RFP、INH、OFLX、SM对耐药结核分枝杆菌抗结核药物MIC研究.结果 本研究测试的14株耐药菌株中,7株MIC值为256μg/mL,6株MIC值为128μg/mL,1株MIC为512μg/mL,MIC50为256μg/mL,MIC90为256μg/mL.16株敏感株中,MIC50为128μg/mL,MIC90为256μg/mL.两者差异无统计学意义(P＞0.05).此外,当ASN终浓度为32 ～ 128μg/mL时,能明显改善耐药MTB对RFP、INH、OFLX、SM等抗结核药物的敏感性.结论 ASN对抗耐药结核分枝杆菌作用可能甚微,但其能协同或逆转抗结核药物改善耐药MTB的药物敏感性,可能成为耐多药结核治疗备选新药.

目的 建立一种用于分枝杆菌快速药物敏感性试验(简称“药敏试验”)的3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠(XTT)/1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯(1-methoxy-PMS,mPMS)组合显色系统(简称“XTT/mPMS”),并加以评估.方法测试XTT分别与mPMS及2-甲基-1,4-萘醌(2-methyl-1,4-NQ,mNQ)两种中间电子受体的最佳组合浓度、检测线性范围、反应时间、稳定性、细胞毒性、药物干扰作用等特性.以固体培养法作为金标准评估XTT/mPMS用于结核分枝杆菌临床分离株最低抑菌浓度(MIC)的药敏试验性能,并与刃天青显色法结果比较.结果 XTT/mPMS和XTT/mNQ两种组合系统中,XTT和中间电子受体的最优组合浓度分别是0.2 mmol/L和0.04 mmol/L.这两种组合系统中,对耻垢分枝杆菌的显色反应较对牛分枝杆菌和结核分枝杆菌更为迅速(XTT/mPMS组合系统分别为60 min、420 min、420 min;XTT/mNQ组合系统分别为60 min、420 min、420 min).XTT/mPMS和XTT/mNQ对3种分枝杆菌均为低毒性,能延长其到达稳定期的时间(约滞后12～48 h).XTT/mPMS与7H9液体培养基在37℃恒温中共培养,以及长时间储存中均具有较高的稳定性(37℃共培养可维持8d,25℃条件下稳定性不低于15 d,4℃条件下稳定性不低于30 d).以固体培养法为金标准,XTT/mPMS用于结核分枝杆菌临床分离株的快速药敏试验(利福平、异烟肼)检测中,其特异度[分别为100.0％(17/17)和100.0％(13/13)]和敏感度[分别为95.7％(22/23)和92.6％(25/27)]与刃天青显色法[特异度分别为100.0％(17/17)和100.0％(13/13);敏感度分别为100.0％(23/23)和92.6％(25/27)]基本一致.结论 本实验室发现XTT/mPMS组合显色系统稳定、低毒、价格低廉,适合于对分枝杆菌进行快速药敏试验.

目的 试验测评纳米CuO在体外培养条件下离子化水平及其对细胞毒性贡献率.方法 粒径为40和200 nm的近球型CuO纳米颗粒 (CuO-NPs) 用于测试.以超滤离心滤过液中铜元素的含量代表CuO-NPs的离子化水平.ICP-MS方法 用于铜元素含量测定.细胞毒性试验设CuO-NPs (40和200 nm粒径) 组、CuSO4组、HPMC组和无处理组.在添加和不添加D-青霉胺 (D-PA) 情况下给A549细胞染毒, 分别于染毒后6和24 h采用刃天青法测算细胞抑制率 (IR) 并计算离解铜离子对细胞毒性贡献率.结果 在CuO-NPs-DMEM/F12体系中, 40和200 nm CuO-NPs在孵育6 h时滤过液中铜离子测定浓度分别为 (3.6±0.1) 和 (2.8±0.2) mg/L, 在孵育24 h滤过液中铜离子测定浓度分别为 (3.9±0.1) 和 (1.8±0.1) mg/L, 上述两个时间点下40 nm CuO-NPs滤过液中铜离子测定浓度均显著高于200 nm CuO-NPs (P<0.05) .细胞毒性试验结果 显示, 在添加D-青霉胺情况下, 40和200 nm CuO-NPs对A549细胞作用6 h的细胞抑制率分别是64.7％和47.2％, 作用24 h的细胞抑制率分别是87.5％和70.9％.在不添加D-青霉胺情况下, 40和200 nm CuO-NPs对A549细胞作用6 h的细胞抑制率分别是90.3％和69.4％, 作用24 h的细胞抑制率分别是95.2％和86.0％.求得40和200 nm CuO-NPs对A549细胞作用6 h的离子化毒性贡献率分别为28.3％和32.0％, 作用24 h的离子化毒性贡献率分别为8.1％和17.6％.结论 CuO-NPs在体外培养体系中发生离子化现象, 离子化水平与CuO-NPs粒径和时间有关.离子化对CuO-NPs细胞毒性具有一定贡献.

目的 考察2-脱氧葡萄糖(2-DG)联合二甲双胍(Met)协同抗人肝癌HepG2细胞作用并探索其机制.方法 刃天青法测定2-DG及Met单独及联合应用对HepG2细胞的生长抑制作用,利用金氏公式计算联合用药Q值;利用高内涵细胞成像系统考察单独及联合用药对细胞线粒体膜电位及活性氧产生的影响;Western blotting检测Cleave-Caspase 3、p-AMPK及p-mTOR的蛋白变化;考察AMPK及mTOR抑制剂对联合用药后细胞生长抑制作用的影响.结果 2-DG、Met单独应用的IC50值分别为2.45及16.35 mmol/L,联合用药对细胞生长抑制具有协同作用,Q值均大于1.15;联合用药能显著降低细胞内线粒体膜电位及p-mTOR蛋白表达,显著增加细胞内活性氧产生及Cleave-Caspase3、p-AMPK蛋白表达;抑制AMPK或mTOR能显著增加联合用药对细胞的生长抑制作用(P＜0.05、0.01).结论 2-DG联合Met具有协同抑制HepG2细胞增殖作用,其机制与降低细胞线粒体膜电位,促进活性氧产生、细胞凋亡,以及非AMPK依赖性的抑制mTOR活化有关.

目的:比较实时细胞分析技术(RTCA)和刃天青法测定氧化铜纳米颗粒(CuO-NPs)对新生大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)的细胞毒性的异同.方法:采用RTCA法确定BMECs细胞毒性实验的最佳细胞接种数量及染毒时间.分别用1.5、0.75、0.38、0.19、0.09 mg/mL的CuO-NPs染毒BMECs,以无细胞的培养液为对照组(0 mg/mL),分别以RTCA法及刃天青法比较其细胞毒性.通过比较2种方法所获得的IC50值判断2种毒性测试方法的相关性.结果:每孔2.5×103个细胞为BMECs最佳接种浓度,接种后40 h为最佳染毒时间.RTCA检测结果表明1.5、0.75 mg/mL的CuO-NPs染毒BMECs后约2 h开始细胞活性降低,并在染毒4 h内全部死亡.通过刃天青法分别在染毒3、12、24、36、48 h进行测定,得到与RTCA相似的结果,即1.5和0.75 mg/mL组的细胞毒性最大,且CuO-NPs对BMECs的细胞毒性呈剂量依赖性趋势.相关性分析结果显示2种方法所获得IC50值相关系数为0.999,P=0.000,具相关性.配对t检验结果显示,差异无统计学意义(t=1.125,P=0.323).从计算IC50的R2值来看,RTCA拟合曲线法R2值高于刃天青法R2值.结论:CuO-NPs体外作用于BMECs具有剂量依赖性的细胞毒性,RTCA方法与刃天青法测定BMECs细胞毒性结果具有相关性,RTCA方法所得结果可能更为准确,更适合于CuO-NPs的细胞毒性研究.

目的 探讨Sigma E(sigma factor E,SigE)基因影响耻垢分枝杆菌对5种药物的敏感性及其作用机制研究.方法 PCR法扩增出耻垢分枝杆菌sigE基因,克隆入质粒pMV261构建重组pMV261-SigE质粒,测序验证.重组质粒电转入耻垢分枝杆菌,Western blot检测SigE的表达.设立含空质粒转化菌为对照组,采用刃天青作为指示剂的微量滴定板法和菌落计数法检测pMV2 61-SigE重组耻垢分枝杆菌对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星和环丙沙星5种抗结核药物的敏感性.采用相应抗生素处理重组耻垢分枝杆菌48 h诱导细菌进入非复制持留状态,随后在含20 ng/mL的结核分枝杆菌复苏促进因子E(resuscitation-promoting factor E,RpfE)的7H9中静置培养2周,计数最大可能数和细菌生长数,测算复苏指数来了解SigE对药物敏感性的影响机制.结果 成功构建pMV261-SigE,经测序鉴定序列正确,Western blot检测到SigE在耻垢分枝杆菌中表达.与对照组相比,表达SigE重组耻垢分枝杆菌组对异烟肼、利福平等5种药物的相对荧光百分比高,敏感性下降.5组抗生素中,异烟肼、乙胺丁醇两种药物作用后pMV2 61-SigE重组耻垢分枝杆菌复苏指数明显高于对照组.结论 SigE可通过促进耻垢分枝杆菌进入持留状态影响异烟肼和乙胺丁醇作用的敏感性.